本发明专利技术涉及化合物１，２５－二羟基－１６－烯－２４－氧代－胆钙化甾醇和１，２４，２５－三羟基－１６－烯－胆钙化甾醇，它们刺激ＨＬ－６０细胞的分化作用，从而它们能用作治疗肿瘤疾病如白血病的药剂，它们还能减少人体角质细胞的增生，从而使它们用作治疗皮肤过度增生疾病如牛皮癣的药剂。它们可通过将１，２５－二羟基－１６－烯－胆钙化甾醇灌注到鼠肾中，提取灌注液并分离出１，２５－二羟基－１６－烯－２４－氧化胆钙化甾醇和１，２４，２５－三羟基－１６－烯胆钙化甾醇来制备。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及化合物1，25-二羟基-16-烯-24-氧代-胆钙化甾醇(维生素D3)及1，24，25-三羟基-16-烯-胆钙化甾醇。它们可用下述结构表示 其中W是O或是(H，OH)。它们可用作治疗肿瘤疾病，治疗过度增生性皮肤病及治疗皮脂腺疾病的药剂。本专利技术还涉及含有效量的式Ⅰ化合物及药学上可接受的载体的药用组合物，以及式Ⅰ化合物在制备刺激HL-60细胞的分化作用或减少人体角质化细胞增生的药物方面的用途。式Ⅰ化合物(下文也称为1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3及1，24，25-(OH)3-16-烯-D3是1，25-二羟基-16-烯-胆钙化甾醇(下文称为1，25-(OH)3-16-烯-D3)的代谢产物。它们可以通过将1，25-(OH)2-16-烯-D3灌注到鼠的肾内，提取灌注液，分离出式Ⅰ化合物来制备。我们惊异地发现，1，25-(OH)2-16-烯-24-氧代-D3和1，24，25-(OH)3-16-烯-D3能抵抗来自其它羟化酶的进一步水解作用。式Ⅰ化合物能刺激HL-60细胞的分化作用，因而能使该化合物用作治疗肿瘤疾病例如白血症的药剂。它们还能减少人体角质化细胞的增生，因而使该化合物能用作治疗过度增生性皮肤病例如牛皮癣，基础细胞癌，角质化症及角化病的药物。对于治疗过度增生性皮肤病，例如牛皮癣，基础细胞癌，角质化疾病及角化病，式Ⅰ化合物能以表皮给药的方式用于需要这种治疗的病人，例如剂量范围为每克皮肤表面配剂1-1000μg。式Ⅰ化合物也能以口服给药的方式治疗肿瘤疾病如白血症，以及治疗过度增生性皮肤病如牛皮癣，基础细胞癌，角质化症及角化病，例如其剂量范围为每天0.1-10μg。1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3能诱发人体前髓细胞的分化作用，因而使该化合物可用于治疗肿瘤疾病，该化合物的活性可通过下述本
公知的试验方法说明1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3在HL-60细胞形态学分化作用方面的效果。a)方法所采用的组织培养基是补充了谷氨酰胺，抗生素和20%牛胎儿血清的RPMI-1640(Gibco)。将1，25(OH)2-16-烯-D3和1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3溶于足量的乙醇中，得到1mM的储备液。当处理该化合物时应避光并储存于暗处的-20℃氩气氛中。储备液在上述组织培养基中被稀释至下表1所指出的浓度。将储备液放入烧瓶中，补加足量乙醇，使最终浓度为0.1%。HL-60肿瘤细胞株最初从前髓细胞白血症病人体内得到，并可从American Type Culture Collection(ATCC＃CCL240)得到。将该细胞在组织培养基中一周两次连续传代保存在液体培养物中。对每个试验点，使细胞在复制烧瓶中生长，将该细胞以每瓶106个细胞的比率接种并于上述化合物存在下生长共4天。作为载体的乙醇在每个试验的所有稀释度下应保持恒量，以便不影响在所用浓度下(＞0.1%)该细胞的分化作用。于37℃温育4天后，评价培养物的细胞分化作用。通过氮兰四唑(NBT)还原的生物化学方法来定量被分化的细胞，将1ml细胞悬浮液从每个烧瓶中取出，离心10分钟，再悬浮于约200μl工作溶液中，该工作溶液每mlNBT含100ng十四烷酰佛波醇乙酸乙酯并存放于放在冰上的有盖的管形瓶内。NBT在计数当天被制成新鲜的在生长基中的浓度为1mg/ml。该细胞在37℃水浴中温育30分钟，取一部分放入血球计，测定每约200个细胞中的兰-黑细胞总数，然后计算被分化细胞的百分比。b)结果其结果，其中包括诱发50%细胞分化的化合物浓度(ED50)列于表1 这些数据表明，1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3的效力比母体化合物1，25-(OH)2-16-烯-D3要大。而且，对于1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3，引起50%细胞分化所必须的有效剂量(ED50)仅为约0.035μM，而对于母体化合物1，25(OH)2-16-烯-D3，ED50值为约0.08μM。从上述结果可以看出1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3能诱发人体前髓细胞的分化作用。因之，1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3能刺激HL-60细胞的分化，因之能将它用作为治疗肿瘤疾病例如白血病的药物。化合物1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3能减少人体角质化细胞的增生，因此使该化合物可用于治疗过度增生性皮肤病，该化合物的活性能通过本领域公知的下述试验方法阐述。角质化细胞增生期间形态学变化的定量所需材料及方法。1.培养条件。通过包皮环切术收集人体新生期的包皮，并放于含Dulbeccos Modified Eagle′s Medium(DMEM)中，其中含10%血清。一到达试验室里，就将它们整理修剪掉过量的真皮，并在4℃下用胰蛋白酶/EDTA(0.05%/0.02%)溶液处理过夜。从真皮中剥下表皮，并于含大豆胰蛋白酶抑制剂的缓冲盐水中搅拌，以便除去基础角质化细胞，除去角膜层。将被分开的细胞离心，再悬浮于上述介质中，计数。并将该细胞放于塑料培养碟或盘中，其在角质化细胞生长介质(KGM)中的密度为25，000细胞/cm2。将该培养物于37℃有5%CO2的加湿室中温育。每周再往该培养物中加新鲜的介质2-3次。达到融合前，将于KGM中的细胞再放于6-孔一组的盘中，每孔为25，000个细胞(第一批)。2.试验化合物溶液。1毫克量收集在琥珀色玻璃管形瓶中，并储存于-20℃下。将足量的100%乙醇加到该管形瓶中得一毫摩尔溶液，随后再将后者连续分配到小的琥珀色管形瓶中，用氩气复盖，储存于20℃。每一储备溶液解冻一次，使用后丢弃。取一部分储备溶液直接稀释到介质中，然后连续从微摩尔稀释到10-12M的浓度。在10-8-1012M的稀释液中加乙醇，达到最终浓度为0.1%。储存溶液供一个月内使用，对照培养物用0.1%乙醇处理。3.细胞增生。第一步后约24小时，在细胞中再添加新鲜的KGM，并补充到含1.5mM CaCl2(试验1)，其中含试验化合物。在第二个试验中(试验2)该细胞在KGM中生长，未补加刺激更多增生的钙，并且生长7天而不是5天。化合物在四个浓度下进行试验，并且每个浓度下作三份。试验终止时，在培养物达到融合之前，细胞按如下方法被计数。小碟用磷酸缓冲盐水淋洗，然后用胰蛋白酶/EDTA溶液孵化15分钟。将细胞悬浮，取一部分放入等渗缓冲盐水中，用电子颗粒计数器计数。计数器应周期性地校准，以便核准角质化细胞的大小。每一孔计数三次，每个碟中的细胞数量依采用的稀释因子进行计算。表2中所列结果是在对照培养物中得到的百分抑制。表2 试验1的数据表明，1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3和1，25(OH)2-16-烯-D3在较低剂量下具有某些抗增生活性，虽然这种活性不依赖于剂量。但是，试验2的数据表明，1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3和1，25(OH)2-16-烯-D3在较低浓度下有较强的抗增生活性。而且在低钙及较迅速分裂细胞中，1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3和1，25(OH)2-16-烯-D3表现出良好的剂量对曲线的依赖。两个试验的差别可能是由于在高的细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
化合物：１，２５－二羟基－１６－烯－２４－氧代胆钙化甾醇和１，２４，２５－三羟基－１６－烯－胆钙化甾醇。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：JA麦克莱恩，SG雷迪，MR厄斯考克维思，
申请(专利权)人：弗哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]
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