产生小麦蛋白水解物的方法技术

本发明专利技术涉及使用微生物内肽酶产生小麦蛋白水解物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】涉及序列表本申请含有计算机可读形式的序列表，所述计算机可读形式通过提述并入本文。 专利
本专利技术涉及使用微生物内肽酶。
技术介绍
小麦蛋白水解物传统上用作食物添加剂，现在已经在全球用于烹调，例如，用于香 味形成(flavour formation) 0小麦蛋白水解物还用于(例如，在运动饮料中)蛋白质强 化(protein fortification)，这是因为小麦蛋白与例如大豆蛋白相比，提供更高水平的谷 氨酰胺，以及用于其他膳食饮料(dietary drink)、干混饮料(dry blended beaverage), 营养条(nutritional bar)等中。小麦蛋白水解物可使用蛋白水解酶水解小麦蛋白来制 备。在小麦蛋白水解物的工业制备中，所述水解蛋白的高溶解度或可悬浮性无论从加工的 角度，从单纯产量/经济(yield/economical)的角度而言，还是口感和感觉特点(sensory attribute)而言都是重要的。因此，对本专利技术人来说一个目的是鉴定对于制备具有高溶解 度的小麦蛋白水解物有用的蛋白水解酶。之前已经描述了发现可适用于本专利技术的内肽酶。例如，来源于拟诺卡氏菌属 (Nocardiopsis)菌种NRRL 18262的内肽酶公开于WO 88/03947 (其中，该菌株称为拟诺 卡氏菌属菌种菌株10R)以及WO 01/58276。其他相关的根据本专利技术有用的内肽酶公开于 W088/03947、W004/111220、W004/111222、W004/111223、W005/123911 和 W004/072279。
技术实现思路
本专利技术人鉴定了下述内肽酶，其被发现适用于制备具有高溶解度并得到均一悬浮 物的小麦蛋白水解物。所述内肽酶与本领域使用的其他内肽酶相比，当以等量的酶蛋白相 比时更加有效，这导致小麦蛋白水解物生产者的产物更经济。因此，本专利技术涉及产生小麦蛋 白水解物的方法，包括a)将与SEQ ID NO 1具有至少50%同一性的内肽酶添加至包含小 麦蛋白的组合物；和b)温育以水解所述小麦蛋白。专利技术详述内肽酶本文中所使用的术语内肽酶是水解内肽键(internal peptide bond)的酶(具有 内肽酶活性)。对于根据本专利技术使用的内肽酶的来源并无限制。因此，术语内肽酶不仅包括天然 或野生型的内肽酶，还包括其显示内肽酶活性的任何突变体、变体、片段等，以及合成的内 肽酶，如经改组的内肽酶。可如本领域所公知的制备经遗传工程改造的内肽酶变体，例如， 通过定点诱变，通过PCR (使用包含所需突变的PCR片段作为所述PCR反应中的引物之一)， 或通过随机诱变。内肽酶变体的实例，如用于本上下文中，是其中一个或多个氨基酸被缺 失、插入或以其他氨基酸取代的内肽酶。根据本专利技术使用的内肽酶的实例是(i)来源于拟诺卡氏菌属菌种NRRL 18262的内肽酶，其公开于W001/58276，其序 列如本申请文件的SEQ ID NO 1所示；(ii)与⑴的内肽酶具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90或至少95%氨基酸 同一性的内肽酶；(iii)⑴或(ii)的内肽酶的显示内肽酶活性的突变体、变体或片段。就本专利技术而言，两个氨基酸序列的比对可以通过使用EMBOSS程序包(http:// emboss, org)版本 2. 8. 0 的 Needle 程序来确定。Needle 程序执行 Needleman，S. B.和 Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48，443-453 中描述的全局比对算法(global alignment algorithm)。使用的取代矩阵是 BL0SUM62，缺口产生罚分(gap opening penalty)是 10， 并且缺口延伸罚分(gap extension penalty)是 0· 5。两个氨基酸序列之间的同一性程度这样计算，用两个序列的比对中的精确匹配的 数目除以两个序列中最短序列的长度。结果以同一性百分比表示。当两个序列在重叠的相同位置具有相同的氨基酸残基时，出现精确匹配。序列的 长度为序列中的氨基酸残基的数目(例如SEQ ID NO :1的长度是188)。作为可适用于本专利技术的细菌内肽酶的实例，还可提及的是W088/03947中 公开的来自白拟诺卡氏菌(Nocardiopsis alba)(先前为达松维尔拟诺卡氏菌 (Nocardiopsis dassonvillei)NRRL 18133的内肽酶；来自达松维尔拟诺卡氏菌达松维 尔亚种(Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei)DSM 43235、白拟诺卡氏菌 DSM 15647、拟诺卡氏菌属菌种DSM 164M的内肽酶和合成的蛋白酶22，全部四种公开于 W004/111220 中；W004/111222 中公开的来自葱绿拟诺卡氏菌(Nocardiopsis prasina) DSM 15648的内肽酶；W004/111223中公开的来自葱绿拟诺卡氏菌DSM 15649的内肽酶； 来自葱绿拟诺卡氏菌(先前为白拟诺卡氏菌)DSM 14010、嗜碱拟诺卡氏菌(Nocardiopsis alkaliphila)DSM44657 和卢森坦拟诺卡氏菌(Nocardiopsis lucentensis)DSM 44048 的 内肽酶，全部三种公开于 W005/123911 中；来自 Brachysporiella gayana CGMCC 0865、绿 僵菌(Metarhizium anisopliae)、粘帚酶属菌种(Gliocladium sp.)CBS 114001、黑团孢 属菌种(Periconia sp.)CBS 114002、黑团孢属菌种 CBS 114000 和新月弯孢(Curvularia lunata)CBS 114003的内肽酶，全部六种公开于W004/072279中；以及这些显示内肽酶活性 的突变体、变体或片段。根据本专利技术使用的内肽酶是微生物内肽酶，优选细菌内肽酶，术语“细菌的 (bacterial) ”表明所述内肽酶衍生自或起源于细菌，或是源自细菌的类似物、片段、变体、 突变体或合成内肽酶。其可在原始野生型细菌菌株中、在另一微生物菌株中或在植物中产 生或表达；即所述术语涵盖野生型、天然存在的内肽酶的表达，以及重组内肽酶、遗传工程 内肽酶或合成内肽酶在任何宿主中的表达。在本专利技术的方法中，内肽酶可以是纯化的。术语“纯化的”用于本文包括富集了 所述酶蛋白的酶蛋白制备物。上述富集可为，例如，去除了产生胞外酶蛋白的生物的细胞， 通过蛋白质特异性沉淀去除非蛋白物质，或使用色谱法，其中所述酶蛋白被选择性吸附并 从色谱基质中洗脱。所述内肽酶可经纯化至这样的程度使得仅仅存在少量的其他蛋白 质。表述“其他蛋白质”具体而言指其他酶。用于本专利技术方法的内肽酶可为“基本上纯的(essentially pure) ”，S卩，基本上不含来自产生它的生物的其他组分，所述生物可为天然 存在的微生物，或经遗传修饰的供重组产生所述内肽酶的宿主微生物。然而，对于本专利技术的使用，内肽酶不需要那么纯。其可以(例如)包括其他酶，甚 至其他内肽酶。在一个优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生小麦蛋白水解物的方法，包括：　　ａ）向包含小麦蛋白的组合物添加与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１具有至少５０％同一性的内肽酶；和　　ｂ）温育以水解所述小麦蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2008-6-3 08157452.71.一种产生小麦蛋白水解物的方法，包括a)向包含小麦蛋白的组合物添加与SEQID NO :1具有至少50%同一性的内肽酶；和b)温育以水解所述小麦蛋白。2.权利要求1的方法，其中所述内肽酶与SEQID NO 1具有至少60%的同一性。3.权利要求1的方法，其中所述内肽酶与SEQID NO 1具有至少80%的同一性。4.前述任一项权利要求的方法，其中所述内肽酶的最适pH为pH9.5至？!1 10.5。5.前述任一项权利要求的方法，其中在pH9时所述内肽酶的最适温度为至少60°C。6.前述任一项权利要求的方法，其中所述内肽酶来自拟诺卡氏菌属。7.前述任一项权利要求的方法，其中所述内肽酶以每千克小麦蛋白1...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉特B林格里夫，珀M尼尔森，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]