应用低聚糖苷作为细菌粘连的抑制剂制造技术

含有至少一个末端Ｌ－岩藻糖单元的二－或低聚糖苷在制备用于治疗或预防与人胃粘膜幽门螺旋菌感染有关的人的疾病的药用组合物中的应用。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及含有至少一个末端L-岩藻糖单元的二-或低聚糖苷在制备用于治疗或预防与人胃粘膜中幽门螺旋菌感染有关的人的多种疾病的药用组合物中的应用，此外还涉及应用所述二-或低聚糖苷治疗上述疾病的方法。本专利技术的背景幽门螺旋菌是微量需氧的螺旋状细菌(原来确定为弯曲杆菌属)，它在胃中被发现，并且一般看来似乎在人的胃肠粘膜中是其唯一的生境。据估计，当人的年龄达到60岁时，60％以上的成人胃粘膜会感染幽门螺旋菌。此外，幽门螺旋菌作为致病因子与许多病理疾病有牵连，包括急性(B型)胃炎、胃和十二指肠溃疡以及胃腺癌。细菌的组织向性部分地由细菌株在其特定生境中调节局部化学环境的能力所决定。此外，为了防止从该新的生境移动，粘连是移地发育必需的先决条件，例如通过在胃肠道中蠕动。在哺乳动物中，细菌粘连到蛋白质或糖共轭体(糖鞘脂类、糖蛋白)上，或上皮细胞表面(粘膜)附近以及许多特定细菌的细菌细胞表面配基-蛋白质和细菌细胞表面配基-糖相互作用在文献中已有叙述。关于幽门螺旋菌在模型系统(例如小鼠肾上腺Y-1细胞)中的研究，D.G.Evans，D.J.Jr.Evans，和D.Y.Graham(1989)(Infect.Immun.57，2272-2278)提出了与表面有关的弯曲微丝结构，该结构使得该细菌具有细菌细胞表面配基或移地发育因子抗原的功能，以便作为引起幽门螺旋菌与含有细胞唾液酸的糖蛋白受体结合的媒介。本专利技术的概要通过对幽门螺旋菌和人胃粘膜上皮细胞之间相互作用的研究，现在人们惊奇地发现，第一，幽门螺旋菌只是与由胃单元组成的含腺上皮中的某些分化的上皮细胞粘连或结合。在含腺上皮中的胃单元与已分化的细胞一起排成行列，以实施各种功能。因此，胃单元的上部凹区域(胃小凹)与粘膜产生的表面上皮细胞一起排成行列，而胃单元缩窄的中央部分(胃峡)是由增殖的和非增殖的发育末全的细胞、粘液颈细胞和壁细胞组成，胃单元的较低部分(腺体)可以含有产生固有因子和胃蛋白酶原的主要细胞、产生酸的壁细胞、粘液颈细胞和腺细胞，以及各种类型肠内分泌细胞。本研究已经表明，幽门螺旋菌只与上部胃小凹中产生粘液的表面上皮细胞(即表面粘液细胞)结合。第二，本研究表明，幽门螺旋菌与产生粘液的表面上皮细胞的结合不涉及在细菌的细胞表面配基(adhesins)和含有唾液酸的受体之间的相互作用，但是涉及与含有L-岩藻糖(也称为6-脱氧-L-半乳糖)末端单元的糖结构之间的相互作用。因此，一方面，本专利技术涉及含有至少一个末端L-岩藻糖单元的二-或低聚糖苷在制备用于治疗或预防与人胃粘膜中幽门螺旋菌感染有关的人的多种疾病的药物组合物中的应用。本专利技术也涉及治疗和/或预防由幽门螺旋菌感染引起人的多种疾病的方法，该方法是给需要治疗的患者使用有效剂量的含有至少一个末端L-岩藻糖单元的二-或低聚糖苷。本专利技术的详细说明在本专利技术的上下文中，术语“末端L-岩藻糖单元”是意指通过1-位连结的、本身未被其他糖单元或基团糖基化的所述一个或多个L-岩藻糖单元。但是，这不排除由L-岩藻糖单元糖基化的糖单元本身被其他糖单元或基团糖基化。在本专利技术的上下文中，术语“低聚糖”是意指糖苷的糖部分含有3个或更多个糖单元，例如3-10个糖单元。按照本专利技术，具有至少一个末端L-岩藻糖单元的二-或低聚糖苷是较优选的，它们可以与存在于幽门螺旋菌表面的细菌细胞表面配基结合。目前，测定含有至少一个末端L-岩藻糖单元的二-或低聚糖苷抑制幽门螺旋菌与胃上皮细胞结合能力的最有用的模型系统，是涉及应用含有胃上皮的人胃组织的组织切片的体外组织学模型。因此，本专利技术的用途或本专利技术方法的较好具体实施方案是其中含有末端L-岩藻糖单元的二-或低聚糖苷能够抑制或明显地减少幽门螺旋菌细胞与人胃粘膜组织切片中上皮细胞的粘连。更好的是，当将幽门螺旋菌细胞与浓度最高到500μm/ml的二-或低聚糖苷一起进行预培育时，与相应的非-预培育的细菌细胞的粘连相比，用于本专利技术用途或方法中的二-或低聚糖苷能够至少50％地抑制上述细菌细胞与人胃粘膜组织切片的上皮细胞的粘连。在目前较好的组织模型系统中，人胃粘膜的组织切片是用下述方法制备的用福尔马林固定非-病变的人胃粘膜组织标本，将标本嵌入石蜡中，得到嵌入了标本的约5μm切片，将该切片置于载玻片上，用二甲苯和异丙醇洗涤脱去切片上的石蜡，切片与缓冲液一起培育，该缓冲液为磷酸盐缓冲的盐水，其中含有牛血清白蛋白和非离子型表面活性剂聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯(如吐温-20)，优选浓度分别为0.2％和0.05％，参见实施例。为了测定幽门螺旋菌细胞与胃粘膜切片粘连的程度，以某种方式将所述细菌细胞标记是有利的，以便在切片的具体位置上能检出该细菌细胞。所述标记方法相信可以按照标记活的细菌细胞或标记固定在显微镜标本上细菌细胞的任一已知方法进行，例如用染料(如用对革兰氏阴性细菌染色的染料)染色，接着用显微镜检查；用放射性同位素或含有同位素的化合物进行标记，接着用微观自动放射显像术检查；用标记的(酶标记，放射性标记等)抗体识别的幽门螺旋菌进行处理(在与上皮细胞粘连之前或之后)，然后用第二抗体酶共轭体或ELISA类型检查或用微观自动放射显像术检查或显影粘连的抗体。然而，当前优选的标记方法是荧光标记法，尤其是用异硫氰酸酯(isothiocyanate)荧光素进行标记。该法可以有利地按下述方法进行将幽门螺旋菌细胞在缓冲液(含有氯化钠和碳酸钠，优选浓度分别为约0.15M和0.1M，pH约9.0)中的混悬液用浓度约0.1mg/ml异硫氰酸酯荧光素处理，在室温下培育细菌细胞混悬液1小时，离心分出细菌细胞，接着用含有非离子型表面活性剂聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯(优选浓度为约0.05％)的磷酸盐缓冲的盐水(pH约7.5)洗涤所述细菌细胞。为了测定具有至少一个末端L-岩藻糖单元的二-或低聚糖苷抑制幽门螺旋菌与人的胃肠道上皮细胞粘连的能力，在使该细菌与组织切片进行接触之前，通常将该细菌与所述糖苷一起进行预培育，以便使该细菌粘连到上皮细胞的表面。预培育细菌细胞的一个常用的方法是将浓度最高到500μg/ml的二-或低聚糖苷加到细菌细胞有缓冲液的混悬液中，并于室温下一起预培育2小时，所述缓冲液为磷酸盐缓冲的盐水(pH约7.5)，其中含有牛血清白蛋白和非离子型表面活性剂聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯，优选浓度分别约为0.2％和0.05％，然后经离心分离细菌细胞，并用相同缓冲液洗涤该细胞。如果测定幽门螺旋菌的细胞(不论是否预培育，不论是否标记)与人胃肠粘膜中上皮细胞粘连的能力，通常是将稀释的幽门螺旋菌细胞混悬液(含有约106～108细菌细胞/ml)加到组织切片中，于室温和调湿室中将所述切片与细菌细胞混悬液一起培育1小时，以磷酸盐缓冲的盐水洗涤载玻片，并确定切片的上皮细胞粘连的程度。在具体实施例中，如果所述细菌为荧光(例如异硫氰酸酯荧光素)标记的，那么通过在荧光显微镜下研究切片，可以典型和方便地确定粘连的程度，并且可以从附着到切片上皮表面细胞的荧光细菌的数目评定粘连的程度。参见实施例，尤其是下面附图说明。粘连试验可以用幽门螺旋菌株NCTC 11637、NCTC 11638、WV 229或P466进行(参见下面的实施例)。应用本专利技术制备的药用组合物以及本专利技术的方法可以治疗或预防本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：扬·施塔芬·诺马克，佩·法尔克，托马斯·波伦，
申请(专利权)人：扬·施塔芬·诺马克，佩·法尔克，托马斯·波伦，
类型：发明
国别省市：