本发明专利技术提供了用于检测猪肺炎支原体的实时荧光定量ＰＣＲ引物以及使用其进行定量检测的方法。猪肺炎支原体是猪地方流行性肺炎的主要病原，其极难培养，形态太小不易借助显微镜定量检测，而传统的支原体ＣＣＵ检测方法和ＣＦＵ检测方法耗时长，且污染几率高，且培养基、操作方法或判断标准的不同都可能导致检测结果不一致，难以实际应用。本研究建立的实时荧光定量ＰＣＲ检测方法利用已知浓度的含目的基因的标准质粒做参照，具有快速、灵敏度高、定量精确的优点，可用于猪肺炎支原体培养物和疫苗半成品的定量或微量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和病原体定量检测
具体而言，本专利技术涉及用于检测猪 肺炎支原体的实时荧光定量PCR引物及探针，以及使用其进行定量检测的方法。更具体地说， 是对肺炎支原体p110基因设计的实时荧光定量的PCR引物及探针，以及使用其进行定量检 测的方法。
技术介绍
猪肺炎支原体(iKyo^/awra tyopramo/ae， Mhp)是引起猪地方流行性肺炎(Swine Enzootic Pneumoniae, EP)的主要病原。猪地方流行性肺炎在又称猪气喘病，具有高发病率， 低死亡率的特点，发病后可出现慢性干咳，生长缓慢，发育迟缓等特点，感染后可引起猪免 疫力降低，从而导致其他病原如胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、肺炎巴氏杆 菌等混合感染，引发猪呼吸道综合征或者其他疾病，严重危害养猪业的发展。Mhp分离困难，需要较长时间，且分离效率较低。即使分离成功，Mhp菌体特征不明显， 显微镜观察菌体无法得到明确的结果。Mhp的固体菌落直径仅500nm，菌落特征与其他支原 体菌落特征区别不明显(毕丁仁，软皮体纲内霉形体的重新分类及最新命名，1997年兽医 微生物学学术年会论文集，第68-71页)，因此分离培养难以成为Mhp的主要诊断方法。在分 子生物学方法得到充分发展前，血清学诊断是Mhp的主要诊断方法，现在仍然被广泛使用， 主要有免疫荧光技术，免疫酶技术，凝集试验，放射免疫酶试验，补体结合试验，间接血 凝试验以及ELISA。其中以间接血凝试验、补体结合试验、ELISA和放射免疫酶试验较为常 用。随着分子生物学检测技术的发展，针对Mhp的诊断方法主要集中于DNA水平上的检测， 包括核酸探针检测和PCR检测。Stemke等(Molecular and Cellular Probes.1989， 3(3): 225-232) 将Mhp DNA的EcoR I酶切片断随机克隆后，用重组产物制成探针，该探针虽然在严格杂交 条件下对Mhp特异，但易与絮状支原体产生交叉反应，可检测到10pg的DNA，但无法直接 检测到病肺中的MhpDNA。随后，有一系列同位素、地高辛标记的探针被开发出来(Ahrens P等，Letters in Applied Microbiology, 1991,12(6): 249-253 ); Satoshi Futo等，Journal of Clinical Microbiology, 1992,30(6): 1509-1513; Kwon D等，Veterinary Pathology, 1999,36(4): 308-313)。 目前核酸探针主要用于基因克隆和克隆产物的鉴定，用于临床病例的检测，其敏感度和特异 性尚需要更进一步的发展，而且探针检测步骤复杂。于是，后来发展出了灵敏度更高、操作 更为简便的PCR检测方法(Blanchard等，Molecular and cellular probes. 1996,10(1): 15-22;of Clinical Microbiology, 1998,36(7): 1984-1988; Sorensen等，Veterinary Microbiology, 1997,54:23-24)。随着nested PCR方法的出现，PCR检测Mhp的灵敏度和特异 性进一步提高，同时临床样品的可检测时期也被延长(Stemke等，Molecular and Cellular Probes.1989， 3(3): 225-232; Stark等，Applied and Environmental Microbiology, 1998,64(2): 543-548; Calasmiglia等，Veterinary Microbiology, 2000， 76(3): 299-303)。Real Time PCR即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法，是在PCR定性技术基础上发 展起来的核酸定量技术(MontgomeryRA等，Cytokine, 1997, 9(10): 717-726)，又称荧光定量 PCR。Real Time PCR不仅广泛应用于于基因表达解析，还广泛应用于SNP分型解析、物种鉴 定、病毒和病原菌的检测、转基因食品的定量分析、导入基因拷贝数的解析等诸多领域。Real Time PCR秉承及发展了普通PCR的快速、高灵敏度检出等优点，同时克服了普通PCR不能 准确定量、容易污染等不足。它不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异 性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、实时性和准确性等特点(张立 国等，生物技术,113(12):39-40;张蓓，国外医学临床生物化学与检验学分册， 2003,24(6):327-329;蔡刚,国外医学临床生物化学与检验学分册,2003,24(6):330-332)。Real Time PCR的原理是利用在PCR反应体系中加入荧光物质，并通过Real Time PCR 检测系统对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测，最终对实验数据进行分析处理的 方法。根据引入荧光信号的方法不同，可将Real Time PCR分为下列几种荧光嵌合法(SYBR GREEN I法)；TaqMan探针法；杂交探针法；分子信标法(Molecular beacons); scorpions方法； cycling探针法(张立国等,2003;张蓓，2003;蔡刚,2003;阳成波等，2003年;Takara， 2006;王小 红，2001; Joseph A. Whelan et al, 2003)。目前应用最广泛的是荧光嵌合法和TaqMan探针法。近年来，国内外开始利用荧光定量PCR技术检测支原体，但目前仅限于Mhp的定性检 测，仍难以真正实现Mhp精确定量检测。本专利技术人经过大量研究和反复实验，筛选出一对以Mhp p110基因为靶序列的引物 pU0realF/R及探针，在此基础上建立了一种能够对Mhp精确定量的TaqMan探针荧光PCR 检测方法。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供用于猪肺炎支原体pllO基因定量检测用的荧光PCR引物及探针序 列，及使用该引物进行定量检测的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现根据己发表在GenBank上的猪肺炎支原体基因组5pll0(p76)基因序列(ACCESSION No. NC—006360)，应用MegAlign软件分析其基因序列， 根据引物和探针的设计原则，利用Primer Express v2,0软件设计荧光定量PCR引物及探针。在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，目前在荧光定量 PCR方法中最广泛使用的TaqMan探针就是运用了这个原理。PCR扩增时在反应体系加入一 对引物和一条模板特异性的荧光探针，该探针为一两端标记的寡核苷酸链，5'端标记一个荧 光报告基团和3'标记一个荧光淬灭基团，探针完整时5'端荧光基团吸收能量后将能量转移 给临近的3'端荧光淬灭基团，因此检测不到该探针5'端荧光基团发出的荧光。但在PCR 扩增中，模板变性低温退火后，T叫酶在引物的介导下，沿模板向前延伸，Taq酶的5' -3' 外切酶活性将本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于对猪肺炎支原体培养物进行实时荧光定量ＰＣＲ检测的引物对及探针，其中所述的引物对及探针特异性针对猪肺炎支原体的Ｐ１１０基因的保守区域。
【技术特征摘要】
1.用于对猪肺炎支原体培养物进行实时荧光定量PCR检测的引物对及探针，其中所述的引物对及探针特异性针对猪肺炎支原体的P110基因的保守区域。2. 权利要求1所述的引物对和探针，其中所述引物对及探针的序列为-P110realF : AGGATACAAACTGAGAAACCGAGCTAPI 10reaR: CAAGACCGAGTGGGTATGACCT 探针TGGACAGATCGGTGATACAACCCCACA3. —种对猪肺炎支原体进行定量检测的实时荧光PCR检测方法，该方法包括下列步骤1) 菌株的培养；2) 对Mhp的基因组的提取；3) 向提取得基因组样品加入权利要求1所述引物对及探针，以及PCR扩增用的户re则^^y WM(2X)、 DDW，得到PCR扩增反应液；4) 将装有PCR扩增反应液的PCR管置于荧光PCR仪上；5) 根据所用的荧光染料类型，选择对应的荧光通道，进行荧光PCR扩增，记录各检测样 本的PCR扩增循环数(Ct);6) 根据各样本的反应Ct值，按照标准曲线判定待检样本中Mhp的拷贝数。4. 权利要求3所述的实时荧光PCR检测方法，该方法使用权利要求2所述的引物对及探 针。权利要求3所述的实时荧光PCR检测方法，其中所述的基因组提取包括-1) 将lm...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯绍华，同弋，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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