抗艾滋病分泌型重组BCG疫苗制造技术

一种含有分泌融合蛋白质的牛分枝杆菌ＢＣＧ菌的疫苗，所述融合蛋白质是在含有信号肽的载体分泌蛋白质的分子表面插入外来抗原肽得到的。构成本发明专利技术的ＢＣＧ分泌融合蛋白质，所述融合蛋白质是在由来自抗酸菌的α抗原的分子表面插入外来抗原肽得到的。由于该融合蛋白质具有极大地增加了的抗原性及免疫原性，因此在给动物接种时可被能有效地识别该抗原的Ｂ细胞识别，有效地诱导产生抗该抗原的抗体。当给动物接种该ＢＣＧ本身时，随着它在动物体内的继续增殖，继续分泌所述融合蛋白质，因此成为非常有用的疫苗。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及含有分泌 融合蛋白质的牛分枝杆菌BCG菌(Mycobacterium bovis BCG以下简称“BCG”)的疫苗，所述融合蛋白质是由外来抗原肽插入含有信号肽的载体蛋白质分子表面得到的。作为具体实施例，可以举出作为载体的含有信号肽的分泌蛋白质是来自抗酸菌的α抗原、外来抗原肽是艾滋病毒表面抗原的抗原肽的疫苗，此疫苗可用于艾滋病的治疗和预防。
技术介绍
自1988年建立BCG的转化体系开始，已尝试用重组DNA技术改良BCG，并将其用作抗各种病原体的疫苗。BCG是牛型结核菌的弱毒株，是用于人体的唯一被认可的活菌苗。其特征有毒性弱、安全，具有较高的佐剂活性，效果持续，廉价，耐热性好，可经口服用。因此人们期望如果改良BCG使之表达抗原，即抗各种病原性细菌和病毒的抗原，这将是极有效疫苗的研制中的先锋。其后建立了分泌和表达目的外来抗原的BCG体系，并期待将其用于疫苗。实际上，已开发了能够表达和分泌通过将来自堪萨斯氏分枝杆菌(Mycobacteriumkansasii)的α抗原作为载体与艾滋病毒HIV-1的gag p17的抗原部位(9个氨基酸)融合得到的融合蛋白质的抗酸菌。另外，据称为HIV-1的感染防御抗原之一的表面抗原中存在的第三可变区域(以下简称为V3区域或V3抗原决定基)中的15个氨基酸残基构成的肽的表达和分泌也获得成功。该V3区域的15个氨基酸残基构成的肽含有杀伤T细胞抗原决定基和B细胞抗原决定基两者。它们均以来自抗酸菌的α抗原作载体，在α抗原的C末端附近的位置融合外来抗原肽。也就是说，抗酸菌分泌融合蛋白质。然而，即使给小鼠接种能分泌V3区域的15个氨基酸残基构成的肽和来自抗酸菌的α抗原的融合蛋白质的BCG，虽然显著诱导了杀伤T细胞，但抗体产生的水平不如期待的那样高。除BCG外，最近在利用病毒载体的疫苗的开发研究方面取得了进展。例如将以流感病毒的表面蛋白质血细胞凝集素和脊髓灰质炎病毒的表面蛋白质VP-1为代表的载体蛋白分别与V3抗原决定基融合产生融合蛋白质，利用重组DNA改良这些病毒使得能够表达融合蛋白质。用如此得到的嵌合体病毒免疫动物的例子已有报道。已知用这些嵌合体病毒免疫的动物可有效地产生抗V3抗原决定基的抗体。来自上述病毒的载体蛋白的高级结构已被阐明。在上述融合蛋白质中，外来抗原肽插入存在于载体蛋白的分子表面且易成为B细胞抗原决定基的环部位插入的。专利技术的公开本专利技术的目的是开发含有分泌融合蛋白质的牛分枝杆菌BCG的疫苗，所述融合蛋白质是将外来抗原插入含有信号肽的载体分泌蛋白质的分子表面得到的。本专利技术的进一步的目的是使BCG可用作疫苗。具体地说，是将含有信号肽的载体分泌蛋白质与外来抗原肽融合得到融合蛋白质，以此制备能表达并分泌融合蛋白质的BCG疫苗，并且修饰该融合蛋白质使之可作为抗原决定基被杀伤T细胞识别，作为抗原决定基被B细胞识别，因此它可以有效地诱导杀伤T细胞，显著提高抗体产生的水平。当给小鼠接种能分泌由V3区域中15个氨基酸残基组成的肽和来自抗酸菌的α抗原的融合蛋白质的BCG菌时，虽然可显著诱导杀伤T细胞，但不象所想的那样显著提高产生抗体的水平。另外，目前已明确V3区域抗体用于黑猩猩后可抵御HIV-1的感染。因此目前研究艾滋病疫苗的主攻方向是开发作为疫苗有效成分的能够诱导产生抗V3区域的抗体的蛋白质。具体地说，可使用含有V3区域的表面抗原gp120作为疫苗，所述抗原是通过基因重组的方法改变动物细胞及昆虫细胞产生的。可是该疫苗的效果并不理想。在任何情况下抗原都可以显著诱导产生V3区域的抗体，这个抗体能抑制艾滋病毒的增殖，而且有预防感染的作用，但至今为止，效果还不很明显。因此，若制造能够显著地诱导产生具有抑制艾滋病毒的增殖、并且能预防感染活性的抗体的抗原并以此作为疫苗使用，这种疫苗将会成为极有希望的疫苗。本专利技术人考虑到，即使在来自抗酸菌的α抗原的C末端的位置融合由V3区域的15个氨基酸残基组成的肽，V3抗原决定基也很难呈现出在艾滋病毒表面抗原中其本来的构象，因此，该抗原决定基很难被B细胞识别。鉴于此，本专利技术人考虑制备能分泌融合蛋白质的BCG并以此作为疫苗。所述融合蛋白质是通过在含有信号肽的载体分泌蛋白质的分子表面插入外来抗原肽得到的。因此，来自抗酸菌的及高级结构已知的载体蛋白是必要的，但是，对以本专利技术中使用的α抗原为代表的来自抗酸菌的蛋白质的高级结构未作过解析。本专利技术人已明确，当以来自抗酸菌的α抗原作为载体表达并分泌外来抗原肽时，使其在来自抗酸菌的α抗原的何种位置融合，从而可以达到最高的抗原性，并成功地开发了能显著诱导产生抗所述外来抗原的抗体的疫苗，以此完成了本专利技术。更详细地说，通过对位于来自抗酸菌的α抗原的氨基酸序列预测为亲水性的区域中的成为α抗原自身的B细胞抗原决定基的区域进行预测和确定，在其附近插入外来抗原肽，可以成功地使BCG分泌具有高抗原性的融合蛋白质，因而成功地开发了能够诱导产生具有防治该病原体感染的抗体的疫苗。也就是说，本专利技术提供了含有分泌融合蛋白质的牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，所述融合蛋白质是在含有信号肽的载体分泌蛋白质的分子表面插入外来抗原肽得到的。作为含有信号肽的载体分泌蛋白质，可举出来自抗酸菌的α抗原。本专利技术优选的疫苗是含有分泌融合蛋白质的牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，所述融合蛋白质是在该α抗原的第184位的Ser残基和第185位的Asp残基之间插入外来抗原肽得到的。作为外来抗原肽，可以举出艾滋病毒表面抗原的抗原肽，特别是艾滋病毒的第三可变区域的抗原肽。本专利技术最理想的疫苗是含有牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，其中艾滋病毒表面抗原的抗原肽是由Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile GlyPro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ser(序列号1)19个氨基酸残基构成的第三可变区域的抗原肽，特别是用于治疗及预防艾滋病的疫苗。本专利技术其他理想的疫苗是含有牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，其中艾滋病毒表面抗原的抗原肽是由Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu GluLeu Asp Lys Trp Ala(序列号13)13个氨基酸构成的来自gp41的抗原肽，特别是用于治疗及预防艾滋病的疫苗。本专利技术的其他理想疫苗是含有牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，其中艾滋病毒表面抗原的抗原肽是以下的由19或18个氨基酸残基构成的第三可变区域的抗原肽，特别是用于治疗及预防艾滋病的疫苗。Asn Thr Arg Lys Ser Val His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe TyrAla Thr Gly Asp(序列号14)(亚型A西、中非)Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe TyrThr Thr Gly Glu(序列号15)(亚型B南北美洲、欧洲、亚洲)Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe TyrAla Thr Gly Glu(序列号16)(亚型C南、中非)Asn Thr Arg Gln Arg Thr His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Leu本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有分泌融合蛋白质的牛分枝杆菌ＢＣＧ菌的疫苗，所述融合蛋白质是在含有信号肽的载体分泌蛋白质的分子表面插入外来抗原肽得到的。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：松尾和浩，中条刚具，山崎晤弘，本多三男，山崎修道，田坂博信，
申请(专利权)人：味之素株式会社，国立予防卫生研究所长代表的日本国，
类型：发明
国别省市：JP[日本]