一种具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质，该脱水素蛋白质是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：１）序列表中的ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１；２）将序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且具有抑菌活性的蛋白质；３）序列表中的ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的１５个氨基酸以上片段；本发明专利技术体外表达的水稻脱水素蛋白质、蛋白质片段及体外合成的片段，均具有对特定革兰氏阳性菌的抑菌活性，提取本发明专利技术公开的植物中的脱水素蛋白质可用于对革兰氏阳性菌的抑制，将本发明专利技术的水稻脱水素蛋白质编码基因转入植物中可提高对生物逆境的抗性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质及应用。
技术介绍
抗生素能够抑制或杀伤病原微生物，其应用对保障人类健康发挥了重要的作用。 然而，由于抗生素的过度使用，增加了细菌的耐药性，导致抗生素的疗效下降。抗菌肽是 生物中存在的具有抗菌活性的小分子多肽，它们是生物抵御病原微生物入侵的一道重要防 线。抗菌肽可以作用于病原菌的细胞膜，使膜去极化或者形成“孔洞”，造成细胞内含物外流 或者肽分子进入细胞内部与靶标作用，进而杀死细菌。由于抗菌肽可作用于细菌的多个位 点，所以不易引起细菌的抗性，并且抗菌谱宽。因此，抗菌肽有可能成为新的抗菌药物。另 外，除临床应用外，抗菌肽的应用领域还包括用于食品防腐剂、饲料添加剂、化妆品领域以 及提高植物抗病性等。第一个报道的抗菌肽是天蚕素(cecropins) (Boman et al, 1974)，随后，蛙皮素 (Magainins)、蜂毒素(Melitins)、防御素(Defensins)等先后被发现(石强等，2000)。三十 多年来，人们鉴别获得了上千个抗菌肽，所采用的主要筛选策略大致可分为如下几种一是 基于分离技术的筛选策略；二是利用差异显示技术筛选抗菌肽编码基因；三是基于同源序 列筛选抗菌肽编码基因；四是用生物信息学方法鉴别抗菌肽；五是高通量筛选鉴别抗菌肽 的策略(王海娇等，2007)。2006年，成雄鹰等发展了一种简便的高通量方法，该方法基于各 种cDNA表达文库或人工合成的oligo表达文库，将支持物(如微孔滤膜)放在含有合适抗 性的固体培养基上，表达文库按一定的密度涂在支持物上，待菌落长到一定大小后，将支持 物转到含有诱导物的培养基上继续培养，然后染色；鉴别克隆或细胞的活性。如果诱导表达 产物对宿主有害，使宿主活性降低或死亡，则死体被染料染色后着色。脱水素(Dehydrin)最早由Close等人发现，这是一类可被外源ABA、干旱及盐分诱 导的蛋白质，这些蛋白质具有很强的亲水性(Close et al，1989)。此后，人们陆续报道了不 同植物中的脱水素质白质。按Dure对逆激蛋白质的分类，脱水素蛋白质属于LEA D-II家 族，分子量从9kD到200kD不等，其结构中一般含有以下三个保守片段Y、K和S片段(Dure et al. 1993)。其中，K片段富含赖氨酸，为所有Dehydrin家族蛋白质所共有，其保守序列 为EKKGIMDKIKEKLPG(Close et al. 1997)。但到目前为止，还没有脱水素蛋白质能够抑制细 菌生长的报道。利用高通量筛选体系，本专利技术人从水稻、青蛙等表达文库中鉴别获得了几十个对 大肠杆菌生长有抑制作用的克隆，与未诱导培养基中细胞的生长相情况比较，细胞生长程 度明显下降。为了进一步验证水稻脱水素蛋白质的抑菌功能，本专利技术利用大肠杆菌体系表 达了脱水素蛋白质及其片段，体外合成了脱水素蛋白质的片段，并进行了水稻脱水素蛋白 质的抑菌活性实验。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质及应用于抑菌实践。本专利技术的第一个目的是提供一种具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质(英文名称 为Dehydrin)，来源于水稻(Oryzae Sativa L.)是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白 质1)序列表中的 SEQ ID NO 1 ；2)将序列表中SEQ ID NO 1的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有抑菌活性的蛋白质；3)序列表中的SEQ ID NO=I的15个氨基酸以上片段；上述具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质(Dehydrin)的编码基因，也属于本专利技术 的保护范围，其核苷酸序列符合下述特征之一1)序列表中SEQ ID No 2的核苷酸序列；2)与序列表中SEQ ID No 2的DNA序列有85%以上同源性，且编码相同功能蛋白 质的DNA序列；3)序列表中SEQ ID No 2的DNA序列中长于45bp的片段，且编码相同功能蛋白 质的DNA序列。本专利技术的另一个目的是水稻脱水素蛋白质在抑菌中的应用。实验证明，所述的水稻脱水素蛋白质或其片段在细菌中表达后，其细菌裂解液或 纯化蛋白质能够抑制短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、黄八叠球菌及金黄色葡萄球菌等革兰 氏阳性细菌的生长，同时，体外合成的所述蛋白质片段能够抑制短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆 菌、黄八叠球菌及金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌的生长。所以，该蛋白质在细菌、真菌或植物中表达或纯化的形式以及含有上述基因序列 的质粒、菌株及转基因植物也可应用于对细菌生长的抑制。本专利技术的有益效果用筛选水稻cDNA表达文库的方法，获得了具有抑菌活性的脱水素(Dehydrin)克 隆，在细菌中表达Dehydrin蛋白质，其裂解液对革兰氏阳性菌具有抑菌活性；将Dehydrin 蛋白质分段表达，表明De-K3片段对短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄八叠球菌、金黄色 葡萄球菌等有明显的抑制效果；进一步体外合成了 Dehydrin片段，也证明具有抑菌活性。 将细菌、真菌或植物中表达的Dehydrin蛋白质或片段掺入饲料、食品和化妆品中，可用于 对细菌的抑制；另外，将Dehydrin基因或片段转入植物，使其编码蛋白质在特定生物逆境 诱导下表达，可提高植物对逆境的抵抗能力；附图说明图1是本专利技术所述的从水稻cDNA文库中筛选获得的RR46克隆的液体培养生长曲线。图2是本专利技术所述的水稻脱水素蛋白质的细菌裂解液的体外抑菌实验结果。1为 诱导后的Dehydrin表达细菌的裂解液；2为诱导后的pET28a空载体表达细菌的裂解液；3 为未诱导Dehydrin表达的细菌裂解液；4为未诱导的pET28a空载体的细菌裂解液。图3是本专利技术所述的De_K3片段裂解液的体外抑菌实验结果。其中1为诱导后的De-K3表达细菌裂解液；2为诱导后的pET28a空载体的细菌裂解液；3为未诱导De_K3表达 的细菌裂解液；4为未诱导pET28a空载体的细菌裂解液；图4是本专利技术所述的体外合成的Dehydrin片段的体外抑菌实验结果。其中1、2、 3所用合成多肽的浓度分别为lmM、0. 5mM和0. 25mM。具体实施例方式下述实施例中所用方法均为分子生物学实验室所用的常规方法。生物材料、主要试剂和仪器水稻表达cDNA文库(载体pBlueSCript，受体菌S0LR)，大肠杆菌菌株 BL21-DE3-pLysS ；表达载体pED8a，指示菌株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)均为本实验室保存。细菌指示菌短小 芽孢杆菌(Bacillus pumilus,CVCC709)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,CVCC717)、大 肠杆菌(Escherichia coli，CVCC1570)、藤黄八叠球菌(Sarcina lutea,CVCC1600)均购买 自国家兽医微生物菌种保藏管理中心。DNA测序及Oligo合成由北京华大基因研究中心完 成，多肽合成由上海华大天源生物科技有限公司完成。IPTG购自北京赛百盛生物技术有限 公司；氨苄青霉素、卡那霉素购自上海生工；微孔滤膜购自北京升本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质，其特征在于所述蛋白质具有下述氨基酸残基序列之一：１）序列表中的ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１；２）将序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且具有抑菌活性的蛋白质；３）序列表中的ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的１５个氨基酸以上片段；。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国振，成雄鹰，翟从劼，李莉云，刘丽娟，兰金苹，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]