寡核苷酸硫代磷酸酯在排除补体和降低血压中的应用制造技术

本发明专利技术公开了在灵长类动物中降低血压、刺激血管舒张、排除补体的方法，这些方法涉及将一种寡核苷酸施用灵长类动物，然后测定血压的降低或补体的活性的降低。所施用的寡核苷酸长度为２－５０个核苷酸，具有至少一个硫代磷酸酯核苷酸间连接键。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
寡核苷酸硫代磷酸酯在排除补体和降低血压中的应用专利技术背景本专利技术涉及合成寡核苷酸的体内补体灭活作用及其结果。更具体地说，本专利技术涉及使用合成寡核苷酸排除补体以降低血压和刺激血管舒张的方法。补体系统是约20种不同血浆酶、酶前体、调节蛋白和下述蛋白质的级联系列，所述蛋白质能够裂解细胞并在对外源细胞的正常免疫系统反应和对个体自身细胞的异常免疫系统反应中起作用。所有这些蛋白质通常存在于血浆中和在血浆蛋白质中，沿毛细血管渗流到组织空间。酶前体通常是非活性的，但可以经两种不同的途径激活：采用补体组份C1、C4和C2的经典途径和通过因子D、C3和B的旁路。两种激活方式均引起组份C3的裂解和激活。从C3裂解的片段C3b是激活终末补体组份C5-C9所必需的。它们形成膜攻击复合物，当插入到细胞膜中时，所说复合物引起外源细胞的渗透裂解，在自体免疫状态下，引起感染生物体自身细胞的裂解。补体级联的激活不仅引起细胞裂解，而且也引起巨嗜细胞和嗜中性白细胞对细菌的条理作用和吞噬作用、侵入生物体的凝集、某些病毒的中和、由C5a引起的嗜中性白细胞和巨嗜细胞的趋化性、嗜碱性粒细胞和肥大细胞的活化和炎症反应(Guyton，Textbook ofMedical Physiology，W.B.Sauders Co.，Philadelphia(1991)pp.374-384)。嗜碱性粒细胞和肥大细胞活化和接下来的组胺释放由片段C3a、C4a和C5a(从C3、C4和C5酶促裂解掉)引发。在补体途径的迅速激活后，嗜中性白细胞着边、hemocentration和血管活性肽释放也有报道(Arnaout et al，(1985)N.Eng.J.Med.312：457-462)。补体的裂解和其它活性也与大量病态有关，所述病态包括各种自体免疫紊乱，例如类风湿性关节炎。类风湿性关节炎是一种慢性多系统疾病，其临床表现为，外周关节的持续炎症性滑膜炎，该炎症导致滑液细胞增生和接下来的血管翳形成、软骨损坏、骨糜烂，并且最终关节变形和丧失关节功能。约1％的美国和欧洲人，约0.2-0.4％的日本人患有这种疾病，女性患此病比男性要常见三倍。治疗方法包括用水杨酸和其它非类固醇抗炎症药、简单的止痛药和低剂量的糖皮质激素控制发炎过程中的症状，但是这些药物都不能有效地阻止类风湿性关节炎的发展(Lipsky in Harrison′s Principles of Internal Medicine(11th ed.)(Braunwald et-->al.，eds.)McGraw-Hill Book Co.，New York，New York(1987)pp.142 3-1428)。大量不同的减轻疾病的药物(例如金化合物、D-青霉胺、糖皮质激素、细胞毒免疫抑药物和抗疟药)已单独和与非类固醇抗炎症药结合使用以提供止痛和抗炎作用(Lipsky，同上)。然而，使用的这些药物有些毒性，某一种不能持续地表现出优于另一种。而且，这些药物都不能表现出改变病程。因此，需要不仅能减轻类风湿性关节炎症状而且能阻止该疾病的治疗方法。某些补体因子是潜在的血管舒张药，它们能影响血压和与血压有关的疾病，如高血压。在许多发达国家，高血压是一个盛行的健康问题。许多患高血压的病人早逝，大多数常见的死因是心脏病、中风和肾衰竭。治疗方法一般包括非药物治疗性条理(包括消除紧张、规定饮食、减轻体重、规律的需氧锻炼)和服用抗高血压药(包括利尿药、抗类肾上腺素能剂、血管舒张药、钙通道阻断剂和血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂)(Gordon Williamsin Harrison′s Principles of Internal Medicine，13th Ed.(Isselbacher等编辑)(1994)McGraw-Hill，Inc.，NY)，1116-1131页)。需要研究一种控制补体系统的方法，使系统组份能找到合成代谢用途，例如，用于治疗与补体敏感性自体免疫与血压相关的疾病。各种动物模型已用于研究补体系统和由缺乏或过度表达各补体组份引起的疾病。这些动物模型已由施用眼镜蛇毒液(导致排除它们的补体)制成。然而，毒液包含不与补体系统相互作用的那些组份。因此，形成的动物反应可能不仅仅是由于存在补体相互作用组份。因此，需要一种较好的补体缺失动物模型，其病态仅仅由与补体缺失因子的相互作用引起。专利技术概述已发现具有硫代磷酸酯(phosphorothioate)核苷酸间连接键的寡核苷酸的快速浓缩药团输注引起受治疗的灵长类动物(primate)补体缺失。已发现这一补体缺失降低受治疗的灵长类动物的血压，同时瞬时降低其中性白细胞和总白血细胞计数。这些惊人的发现已用来完成本专利技术，本专利技术包括在灵长类动物中排除补体、降低血压和刺激血管舒张的一些方法。各方法涉及施用一种寡核苷酸硫代磷酸酯(oligonucleotide phosphorothioate)(一-->种PS-寡核苷酸)，该物质具有在至少一个非桥磷酸二酯核苷酸间连接键中的硫取代氧。在本专利技术的某些方面，所说的寡核苷酸仅具有硫代磷酸酯核苷酸间连接键。如本文所采用的，术语″寡核苷酸″意含两个或多个核苷酸，其中一个核苷酸的5′末端与另一个核苷酸的3′末端经共价键连接。用于本专利技术的方法中的寡核苷酸长度为2-50个核苷酸，在某些实施方案中，长度为6-50和(更优选的)20-30个核苷酸的寡核苷酸非常有用。在本专利技术的其它实施方案中，所说的寡核苷酸具有至少一个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。在另一实施方案中所说的寡核苷酸是嵌合的，即具有在分子中任一位置或序号上的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸两者的组合。在本专利技术的某些实施方案中，所说的寡核苷酸是修饰过的，术语″修饰的寡核苷酸″本文用来指其中至少两个其核苷酸经合成连接键共价连接，所说的合成连接键是不同于在一个核苷酸的5′末端和另一个核苷酸的3′末端之间的磷酸二酯的连接键，其中，5′磷酸酯基已由任何数量的化学基团取代。优选的合成连接键除了硫代磷酸酯外，包括象烷基磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、亚磷酰胺、磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、2-0-甲基和羧甲基酯之类的连接键。这些连接键可以存在于寡核苷酸结构的任何地方，并且在单个寡核苷酸中可以存在多于一种类型的连接键(即，杂种寡核苷酸)。术语″修饰的寡核苷酸″也包括具有修饰的碱基和/或糖基的寡核苷酸。例如，3′，5′-取代的寡核苷酸是具有糖基的寡核苷酸，所说糖基在3′和5′两者上连接到化学基团而不是羟基(在其3′位)和磷酸酯基(在其5′位)上。修饰的寡核苷酸也可以是加帽的种类。此外，在分子中每个核苷酸具有一个非桥氧上取代的未氧化的或特别是氧化的寡核苷酸也被认为是修饰的寡核苷酸。也被认为是修饰的寡核苷酸的是在其3′和/或5′末端具有赋予核酸酶耐受性的大取代基的寡核苷酸，无人工干预非体内发现的结构修饰物这里也认为是修饰的。自身稳定化的寡核苷酸也被认为是在本专利技术的方法中有用的寡核苷酸(Tang et al.(1993)Nucleic Acids Res.21：2729-2735)。这些寡核苷酸包括两个区：靶杂交区和自身互补区(具有互补于自身稳定化的寡核苷酸中的核酸序列的寡核苷酸序列)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降低灵长类动物血压的方法，该方法包括：（ａ）将一种寡核苷酸施用于灵长类动物，所说的寡核苷酸长度为２－５０个核苷酸，具有至少一个硫代磷酸酯核苷酸间连接键；和（ｂ）测定灵长类动物血压的降低。

【技术特征摘要】
US 1994-5-27 08/250,8531、一种降低灵长类动物血压的方法，该方法包括：(a)将一种寡核苷酸施用于灵长类动物，所说的寡核苷酸长度为2-50个核苷酸，具有至少一个硫代磷酸酯核苷酸间连接键；和(b)测定灵长类动物血压的降低。2、权利要求1的方法，其中所说的寡核苷酸按约30-120mg/kg/hr的恒定速率以浓缩药团静脉内输注的方式施用。3、权利要求2的方法，其中所说的寡核苷酸按约30mg/kg/hr的恒定速率施用。4、权利要求2的方法，其中所说的寡核苷酸按约40mg/kg/hr的恒定速率施用。5、权利要求1的方法，其中在10分钟期限内按每千克灵长类动物5-20毫克寡核苷酸施用。6、权利要求1的方法，其中在120分钟期限内按每千克灵长类动物80毫克寡核苷酸施用。7、权利要求1的方法，其中所说的寡核苷酸长度约为6-50个核苷酸。8、权利要求7的方法，其中所说的寡核苷酸长度为20-33个核苷酸。9、权利要求1的方法，其中所说的寡核苷酸包含至少一个脱氧核糖核苷酸。10、权利要求1的方法，其中所说的寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸。11、权利要求9的方法，其中所说的寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸。12、权利要求1的方法，其中所说的寡核苷酸是修饰过的。13、权利要求1的方法，其中至少50％的降低被测得。14、一种刺激灵长类动物血管舒张的方法，该方法包括：(a)将一种寡核苷酸施用于灵长类动物，所说的寡核苷酸长度为2-50个核苷酸，具有至少一个硫代磷酸酯核苷酸间连接键；和(b)测定灵长类动物中至少50％的血压降低。15、权利要求14的方法，其中所说的寡核苷酸按约30-120mg/kg/hr的恒定速率以浓缩药团静脉内输注的方式施用。16、权利要求15的方法，其中所说的寡核苷酸按约30mg/kg/hr的恒定速率施用。17、权利要求15的方法，其中所说的寡核苷酸按约40mg/kg/hr的恒定速率施用。18、权利要求14的方法，其中在10分...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦恩M加尔布雷斯，苏迪尔阿格雷瓦尔，
申请(专利权)人：海布里登公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]