本发明专利技术公开了一种检测恩诺沙星的荧光微球免疫层析检测卡及其制备方法。其构成依次包括滤纸、样本垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的玻璃纤维膜上喷涂有荧光微球标记的抗体；所述的硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区；所述的检测区喷有恩诺沙星与载体蛋白质的偶联物；所述的质控区喷有抗鼠抗体。本发明专利技术以二氧化硅与荧光物质复合的核壳双结构发光纳米粒子为标记，采用竞争阻断模式的免疫层析技术，实现恩诺沙星快速免疫分析。在检测过程中，采用荧光微球最佳激发光源进行激发，发射出的荧光通过滤光片装置后用肉眼观察检测线是否有荧光物质，本发明专利技术具有灵敏度高、检测快速、操作方便、经济实用特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品安全检测领域，具体地说是涉及一种利用荧光微球免疫层析技 术定性检测恩诺沙星的检测卡及其制备方法。
技术介绍
恩诺沙星(Enrofloxacin，ENR)又名乙基环丙沙星，为第一个畜禽专用的氟喹诺 酮类药物，1983年由德国拜耳公司首先研发成功，我国于1994年投放市场。因其能抑制 细菌DNA螺旋酶，抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强，已成为兽医临诊和水产养殖 中最重要的抗感染药物之一，被大量用于治疗、预防疾病和促进生长。该药内服及肌肉 注射吸收迅速，且在体内代谢为同样具有抗菌活性的环丙沙星，代谢物生成及消除均缓 慢，分布广泛。但人类食用被此药物污染的动物食品后，可导致机体内正常菌群产生耐 药性，引起人体中毒或过敏反应，影响体内核酸的合成，具有潜在的致癌性。美国、欧 盟以及我国都对恩诺沙星的使用进行了严格控制。美国禁止使用恩诺沙星于畜禽养殖； 欧盟法规中明确规定恩诺沙星检测标准为鱼肉和脂肪部分为O.lmg/kg，肝、肾部分为 0.2mg/kg。目前，针对恩诺沙星的检测和监控方法包括确证法和筛查法两大类。确证法主 要包括高效液相色谱、气相色谱、逆流色谱、离子色谱、离子阱质谱、等离子质谱、液 质或气质联用等利用高端设备为辅助手段的方法。以上方法虽然敏感、特异、稳定，但 是存在检测时间长，一般条件下检测通量不高，同时需要昂贵的设备支撑，因此确证法 大多用于有疑问事件的仲裁；筛查方法一般是指快速检测方法。ELISA(酶联免疫吸附测 定)以及胶体金免疫层析法是目前国际公认的主流技术，这两种方法具有检测速度快， 价格便宜，操作简单等优点，是目前国内外检测的主要监控方法。但ELISA检测仍需 专业人员，且需要较长的时间显示结果；胶体金法一般情况下对恩诺沙星能进行定性分 析，检测时间比较短(10-15min)。目前国内使用的快速试剂，不管采用何种原理，由于 其灵敏性限制，不能将样品进行多倍稀释，以至于样品中的干扰成分比较多，导致实际 样品检测过程中会产生假阴性或假阳性现象。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是针对上述现有技术的不足之处，提供一种灵敏度高、操作 简便、检测快速、价格低廉的检测恩诺沙星的荧光微球免疫层析检测卡；本专利技术的另一 个目的是提供上述检测卡的制备方法。为了实现上述目的本专利技术采取的一个技术方案是提供一种检测恩诺沙星的荧光微球免疫层析检测卡，该检测卡为单卡型，由一 张免疫层析试纸条、底卡及面卡构成。免疫层析试纸条是在底板上依次搭接地粘贴滤 纸、样本垫、玻璃纤维膜、NC膜(硝酸纤维素膜)和吸水纸而制成的，所述的玻璃纤维 膜上喷涂有荧光微球，所述的NC膜上固定有检测区和质控区；所述玻璃纤维膜上喷涂的荧光微球为荧光微球标记的抗恩诺沙星抗体，所述硝酸纤维素膜上检测区喷涂有载体 蛋白质与恩诺沙星的偶联抗原，所述质控区都固定有抗鼠抗体。所述荧光微球是直径为0.01 Ιμιη的用二氧化硅包裹荧光物质的微球，其表面 连接有活性基团，或与链霉亲和素偶联；所述荧光物质包括有机或无机的荧光物质或多 种荧光物质的掺和物以及量子点。所述的活性基团为-CHO、-COOH、-OH、-NH2或-SH;所述的荧光物质为菲咯啉联钌有机染料、异硫氰根荧光素、异硫氰根罗丹明、6-羧基荧光素酰胺酯、3， 6-二乙氧基荧烷、3-二乙基氨基-7-(2’ -氯苯胺基)荧烷、洛丹明B、洛丹明110、洛丹 明123和洛丹明10、1，8-萘二酰亚胺4-位被烷氧基或芳氧基取代的荧光物质、1，8-萘 二酰亚胺中引入磺酸基，羧基和季铵盐水溶性基团的荧光染料、1，8-萘酸酐与邻苯二胺 缩合所得到的匹茜酮类荧光材料、三氟甲醛香豆素、双荧光团香豆素、1，2，3，3-四甲 基吲哚基团香豆素有机荧光染料或多种荧光物质的掺和物以及量子点。本专利技术采取的另一个技术方案是提供一种上述检测恩诺沙星的荧光微球免疫层 析检测卡的制备方法，具体包括以下步骤1.免疫层析试纸条的制备(1)荧光微球垫的制备用荧光微球标记抗体，并将其喷涂在玻璃纤维膜上。取市售的荧光微球在IOOOXg离心10 15η ι，收集沉淀，用0.01Μ ρΗ 4.8的 硼酸盐缓冲液调节微球浓度为OD45tl = 0.2，然后分别加入20 100mg/ml对乙基-N， N- 二甲基丙基碳二亚胺(EDC) 100 μ 1，2 20mg/ml氮羟基琥珀酰亚胺(NHS) 100 μ 1， 再加入0.01Μ ρΗ4.8的硼酸盐缓冲液，振荡混勻，室温孵育10 30min后，IOOOXg离 心5 15η ι，沉淀用0.01Μ ρΗ 7 8的硼酸盐缓冲液重悬，并调节微球浓度为OD45tl为 0.2 1.0，在0.1ml的该荧光微球中加入1 IOyg抗恩诺沙星抗体，充分混勻后，室温 搅拌反应1 4h，超纯水离心洗涤2 5次，沉淀用0.01M pH 7.2PBS (磷酸盐缓冲液， 其中包含5%蔗糖和0.05% Tween-20)复溶沉淀至起始体积后，用BIODOT操作平台喷涂 至玻璃纤维膜上，25°C真空干燥1 Zh，放于干燥环境备用。(2)检测区和质控区的制备分别将载体蛋白质和恩诺沙星的偶联抗原，抗鼠抗体喷到硝酸纤维素膜上，制 成检测区和质控区；所述的载体蛋白是牛血清白蛋白或卵清白蛋白。用0.01M pH 7.4PBS (磷酸盐缓冲液，其中包含5%蔗糖和0.05%吐温-20)分别 调节偶联抗原和抗鼠抗体的浓度为0.5 S.Omg/ml，喷膜量为0.7 μ L/cm，检测区喷涂偶 联抗原，质控区喷涂抗鼠抗体，两区相隔5mm，质控区距离NC膜一端2mm，37°C烘干 过夜后，在室温干燥环境下保存备用。(3)组装和剪切在粘性底板上依次搭接地粘贴滤纸、样本垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜及 吸水纸，并剪切成适当宽度即成为免疫层析试纸条。2.免疫层析试纸条的组装将根据上述方法制备的恩诺沙星试纸条固定在底卡上，然后在试纸条表面用面 卡压紧，即成为免疫层析检测卡。底卡和面卡一般都为塑料卡，底卡能使试纸条上的样5本垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸紧密结合，面卡可保护试纸条，使其不受损 坏。面卡上预留加样孔和观察窗各两个，加样孔的位置与试纸条的样本垫对应，观察窗 的位置与试纸条的硝酸纤维素膜对应。用上述的荧光微球免疫层析检测卡定性检测恩诺沙星，包括以下步骤(1)免疫层析检测卡的加样孔中加入待检样本，反应3 20min后，将检测卡放 入检测窗口；(2)截留在检测区和质控区的荧光微球在最佳激发灯源下，发出强烈的荧光条 带；C3)发射的荧光经滤除杂光后，用肉眼观察是否有荧光信号；当样本中不含有 被检测物质时，检测区和质控区均出现一条荧光条带，即检测样本为阴性；当样本中 含有过量被检测物质时，检测区无荧光条带，质控区有一条荧光条带，检测样本即为阳 性。当样本中含有不过量被检测物质时，检测区有一条弱荧光条带，质控区有一条 荧光条带，检测样本即为弱阳性。本专利技术的优点如下1.荧光物质被入射光激发后，返回基态时发射出荧光，可以在与激发光源垂直 的方向进行检测，因此荧光不受来自激发光本底的干扰，灵敏度大大提高，其灵敏度是 用传统染料和有色标记物质检测方法的10 1000倍。另外，荧光标记检测方法还具有 操作简便，检测快速，价格低廉等优点；2.荧光微球是本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测恩诺沙星的荧光微球免疫层析检测卡，其特征在于：用于检测恩诺沙星的试纸条。所述试纸条包括：在底板上依次搭接地粘贴的滤纸、样本垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述的玻璃纤维膜上喷涂有抗恩诺沙星抗体与荧光微球偶联物；所述的硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，其硝酸纤维素膜上的检测区喷涂有载体蛋白质与恩诺沙星的偶联抗原；所述试纸条的质控区固定有抗鼠抗体。
【技术特征摘要】
1.一种检测恩诺沙星的荧光微球免疫层析检测卡，其特征在于用于检测恩诺沙星 的试纸条。所述试纸条包括在底板上依次搭接地粘贴的滤纸、样本垫、玻璃纤维膜、 硝酸纤维素膜和吸水纸；所述的玻璃纤维膜上喷涂有抗恩诺沙星抗体与荧光微球偶联 物；所述的硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，其硝酸纤维素膜上的检测区喷涂有 载体蛋白质与恩诺沙星的偶联抗原；所述试纸条的质控区固定有抗鼠抗体。2.根据权利要求1所述的检测恩诺沙星的荧光微球免疫层析检测卡，其特征在于 所述荧光微球是直径为0.01 1 μ m的用二氧化硅包裹荧光物质的微球，其表面连接有活 性基团，或与链霉亲和素偶联；所述荧光物质包括有机或无机的荧光物质或多种荧光物 质的掺和物及量子点。3.根据权利要求2所述的检测的恩诺沙星荧光微球免疫层析检测卡，其特征在于 所述的活性基团为-COOH、-NH2, -CHO、-OH或-SH;所述的荧光物质为菲咯啉联钌 有机染料、异硫氰根荧光素、异硫氰根罗丹明、6-羧基荧光素酰胺酯、3，6-二乙氧基 荧烷、3-二乙基氨基-7-(2’ -氯苯胺基)荧烷、洛丹明B、洛丹明110、洛丹明123和 洛丹明10、1，8-萘二酰亚胺4-位被烷氧基或芳氧基取代的荧光物质、1，8-萘二酰亚胺 中引入磺酸基，羧基和季铵盐水溶性基团的荧光染料、1，8-萘酸酐与邻苯二胺缩合所得 到的匹茜酮类荧光材料、三氟甲醛香豆素、双荧光团香豆素、1，2，3，3-四甲基吲哚基 团香豆素有机荧光染料或多种荧光物质的掺和物及量子点。4.根据权利要求1所述的检测恩诺沙星荧光微球免疫层析检测卡的制备方法，其特征 在于，免疫层析试纸条制备步骤包括(1)荧光微球垫的制备用市售的荧光微球标记抗恩诺沙星抗体，并将其喷涂在玻 璃纤维膜上得到荧光微球垫；(2)检测区和质控区的制备将载体蛋白质与恩诺沙星的偶联抗原喷涂到硝酸纤维 素膜上的检测区范围，制成检测区；将抗鼠抗体喷涂到硝酸纤维素膜上的质控区范围， 制成质控区；(3)组装和剪切在粘性底板上依次搭接地粘贴滤纸、样本垫、喷涂有荧光微球标 记抗体的玻璃纤维膜、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水纸，并剪切成所需 的宽度即成为免疫层析试纸条；按照上述步骤制得检测恩诺沙星试纸条。5.根据权利要求4所述的检测恩诺沙星的荧光微球免疫层析检测卡的制备方法，其特 征在于，所述荧光微球标记抗体的...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈雪岚，杨晓慧，熊勇华，赖卫华，魏华，李林，
申请(专利权)人：北京中德大地食品安全技术开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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