寡核苷酸的环糊精细胞输送系统技术方案

本发明专利技术公开了一种包括与环糊精复合的寡核苷酸的组合物。该寡核苷酸可以和环糊精非共价结合。另外，寡核苷酸可以共价复合上与环糊精非共价结合的金钢烷。还发现了增强寡核苷酸的细胞吸收，提高其细胞内浓度的方法，提高某一寡核苷酸在细胞内的溶解能力的方法，治疗被病毒感染的细胞或使细胞预防病毒感染的方法。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
寡核苷酸的环糊精细胞输送系统专利技术背景本专利技术涉及反义疗法。更为具体地说，本专利技术涉及促进反义寡核苷酸的细胞吸收的组合物及方法。已经研制了那些能够调节细胞及外源基因表达的新的化学治疗试剂。这些试剂，被称为反义寡核苷酸，它们是能够根据Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对法则结合靶核酸分子的单链寡核苷酸，并且以这种方式，通过以下数种机制之一摧毁靶的功能：阻止与正常转录，拼接或翻译所需要的因子的结合；引发RNaseH对RNA的酶解性破坏，或者是通过反应基团与反义寡核苷酸的直接结合而破坏靶。因此，它们已成为特异性抑制基因表达序列的广泛使用的研究工具，并已在进行作为治疗性试剂的可行性审查。(见Agrawalet al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90：3860-3884；Bayever et al.，1992，Antisense Res.Development 2：109-110)。为了使反义分子具有治疗价值，必须使其有能力进入细胞内并且接触到靶子的内源性核酸。另外，它们必须能够抵抗细胞内的高度核酸裂解性环境的严峻挑战。最近的研究已经表明，具有某些修饰，例如人工的核苷酸间的连接的寡核苷酸分子，不仅表现出对核内降解作用的抗性(见Agrawal et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：7079-7083；Agrawal et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：7790-7794；Gao et al.1990，Antimicrob.Agents Chem.34：808；Storey et al.，1991，Nucleic Acids Res.19：4109)，而且能够增强细胞对其的吸收。例如，具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯类的核苷酸间连接(linkage)的寡核苷酸，已被发现能比具有磷酸二酯连接的寡核苷酸更容易结合上，并被吸收到细胞内。(Zhao et al.，1993，Antisense Res.Dev.3：53-56)。寡核苷酸的吸收是可饱和的，序列非依赖性的，以及温度与能量依赖性的。虽然有些证据表明此种吸收可能是通过一种分子量为80,000 dalton的膜蛋白发生的(Loke etal.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3474；Yakubov et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)86：6454)，但这种蛋白的基因还未被克隆或鉴定。有项研究说，寡核苷酸的吸收是通过孔穴式的胞饮机制而非内吞机制(Zamecnick，1994，Proc.Natl.-->Acad.Sci.USA 91：3156)。寡核苷酸的吸收究竟是通过受体介导的内吞途径，还是胞饮机制，或是它们的联合作用，目前仍所知甚少。为了改善细胞对寡核苷酸的吸收，用不同于上述方法的多种途径对寡核苷酸进行了修饰。例如，WO9323570揭示了一种具有改善了的细胞吸收作用的寡核苷酸，在其中至少有一个核苷酸残基在其2’位置共价连接有不同的分子，包括氨基酸，多肽，蛋白质，糖类，磷酸糖类，神经递质，激素，环糊精，淀粉，固醇，或维生素。在抗生物素蛋白存在时生物素化的寡核苷酸的细胞吸收的增强也得到证实(Partridge et al.，1991，FEBSLett.288：30-32)。另外，磷酸二酯键连接的寡聚脱氧核苷酸已通过成孔试剂streptolysin 0导入细胞内(Barry et al.，1993，Biotechniques 15：1016-1018)，而且一种包括阳离子脂类的脂质体制剂也显示出能增强靶子为人类细胞间黏附分子的一部分的反义分子的细胞吸收(Bennett et al.，1992，Mol.Pharmacol.41：1023-1033)。携带5’胆甾醇化修饰的磷酸二酯键连接的寡核苷酸显示了细胞吸收及生物效应的加强(Krieg et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1048)。抗体导向的脂质体也已被用来增强靶子为HIV感染的细胞所表达的HLA-I分子的寡核苷酸的细胞吸收(Zelphati et al.(1993)Antisense Res.Dev.3：323-338)。然而，无论在体内还是在体外实验中，修饰过的与未经修饰的寡核苷酸的吸收的不足仍然是一个难题。因而需要增强细胞对反义寡核苷酸的吸收的改进组合物及方法。这种增强作用的最终结果是提高了反义寡核苷酸的效能并减少了给药的剂量。理想地说，这种组合物和方法还将用来提高寡核苷酸的一般溶解能力。专利技术概述已经发现，反义寡核苷酸被细胞的吸收作用可以通过使这些寡核苷酸非共价结合环糊精而得到增强。这个发现被开发来生产本专利技术的各种组合物。在一个实施方案中，寡核苷酸直接与环糊精非共价结合，优选的环糊精是β-环糊精，γ-2-环糊精，甲基取代的环糊精，或是它们的衍生物。优选的衍生物包括2-羟基丙基-β-环糊精，羟基丙基-γ-环糊精，羟基乙基-β-环糊精，β-环糊精多硫酸酯，三甲基-β-环糊精，以及γ-环糊精多硫酸酯，及甲基取代的环糊精。在本专利技术的一些实施方案中，环糊精所复合的寡核苷酸至少含有一个脱氧核糖核苷酸，一个核糖核苷酸，或是二者都有(即嵌合体寡核苷酸)。在某些实施方案中，寡核苷-->酸通过磷酸二酯键相互连接，而在另一些实施方案中，寡核苷酸是经修饰过的。术语“修饰过的寡核苷酸”用于本文指的是在一个寡核苷酸中至少有两个核苷酸之间是通过一种合成连接方式共价连接起来的，即，在某一核苷酸的5’末端与另一核苷酸的3’末端之间是非磷酸二酯键连接的，其5’核苷酸的磷酸被一些化学基团所取代。优选的合成连接键包括：烷基膦酸酯，磷酸酯，烷基膦酸酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，2-O-甲基碳酸酯，烷基硫代膦酸酯，亚磷酰胺，氨基甲酸酯，磷酸三酯，乙酰胺，以及羧甲基酯。在本专利技术的一个优选实施方案中，寡核苷酸包括至少一个硫代磷酸酯和/或一个烷基膦酸酯连接。术语“修饰过的寡核苷酸”也包括带有修饰碱基和/或糖基的寡核苷酸。例如，一种3’，5’-取代的寡核苷酸是一种修饰过的寡核苷酸，它含有一种糖基，在其3’和5’位置都结合了除羟基(在3’位置)和磷酸基(在5’位置)以外的其它化学基团。修饰过的寡核苷酸还可能是加帽的。另外，在该分子的每个核苷酸的一个非桥式氧上具有一个取代的未氧化的或部分氧化的寡核苷酸也被认为是修饰过的寡核苷酸。那些在其3’和/或5’末端带有抗核酸酶的取代的寡核苷酸以及/或其它一些不经人工介入在体内不存在的带有结构性修饰的寡核苷酸在此也被认为是修饰过的。在另一个优选的实施方案中，本专利技术的组合物中的寡核苷酸共价连接着非共价与环糊精结合的金钢烷。这种共价结合是在寡核苷酸的3’羟基或5’氨基与金钢烷之间。在其它的寡核苷酸含有核糖核苷酸的实施方案中，金钢烷是与核糖核苷酸的2’羟基共价结合。本专利技术还提供一种药物组合物，它包括复合有环糊精的寡核苷酸组合物，优选的是包含于生理学可接受的载体中的。这样的药剂用于增加外源寡核苷酸的细胞吸收，因而能增加细胞内的浓度的方法中。药剂还用于一种治疗被病毒感染的细胞的方法，或使其抵抗病毒的感本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包括与环糊精非共价复合的寡核苷酸的组合物。

【技术特征摘要】
US 1994-6-1 08/252,0721.一种包括与环糊精非共价复合的寡核苷酸的组合物。2.权利要求1中的组合物，还包括与寡核苷酸共价连接和与环糊精非共价复合的金钢烷。3.权利要求2的组合物，其中金钢烷与寡核苷酸的3’羟基或5’氨基共价连接。4.权利要求1的组合物，其中的寡核苷酸包括至少一种选自如下一组的核苷酸间连接方式：硫代磷酸酯，磷酸二酯，烷基膦酸酯，以及它们的结合。 5.权利要求2的组合物，其中的寡核苷酸包括至少一种选自如下一组的核苷酸间连接方式：硫代磷酸酯，磷酸二酯，烷基膦酸酯，以及它们的结合。6.权利要求1的组合物，其中的环糊精选自如下一组：β-环糊精，γ-环糊精，甲基取代的环糊精，和它们的衍生物。7.权利要求2的组合物，其中的环糊精选自如下一组：β-环糊精，γ-环糊精，甲基取代的环糊精，和它们的衍生物。8.权利要求6的组合物，其中的环糊精是2-羟丙基-β-环糊精，羟丙基-γ-环糊精，羟乙基-β-环糊精，β-环糊精多硫酸，γ-环糊精多硫酸，以及它们的混合物。9.权利要求7的组合物，其中的环糊精是2-羟丙基-β-环糊精，羟丙基-γ-环糊精，羟乙基-β-环糊精，三甲基-β-环糊精，β-环糊精多硫酸酯，γ-环糊精多硫酸酯，以及它们的混合物。10.权利要求1的组合物，其中的寡核苷酸包括至少一个脱氧核糖核苷酸。11.权利要求2的组合物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏迪尔阿格雷瓦尔，赵秋燕，伊万哈布斯，
申请(专利权)人：海布里登公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]