聚乙二醇化试剂及由其形成的化合物制造技术

本文公开了由生物活性分子的硫羟基部分与具有活性砜部分的非肽聚合物反应形成的生物活性轭合物。也公开了具有式Ｒ↓［１］－Ｘ－Ｒ↓［２］的化合物，其中Ｒ↓［１］和Ｒ↓［２］至少一个为具有与Ｘ形成共价键的反应性硫羟基部分的生物活性分子，Ｘ为迈克尔受体活化的非肽聚合物。而且也公开了制备本发明专利技术轭合物和化合物的方法以及含有他们的药物组合物。另外，公开了适于与各种分子和表面结合的活性聚合物。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
聚乙二醇化试剂及由其形成的化合物专利
本专利技术涉及聚乙二醇的活性衍生物和相关的亲水性聚合物，并涉及在修饰表面和分子特性中所使用的合成方法。本专利技术也涉及与此活性物共价结合的多肽和制备该多肽的方法。专利技术背景已研究将聚乙二醇(“PEG”)用于药物中，人造植入物上和其它生物相容性重要的应用中。已提出各种PEG衍生物具有允许PEG与药物和植入物和与分子和表面结合的活性部分。例如，已建议使PEG与表面偶合的PEG衍生物，以控制湿润、静态组合和其它类型的分子与表面的结合，包括蛋白质或蛋白质残基。也已提出将PEG用于如从细胞块中亲和分离酶类。在亲和性分离中，PEG衍生物包含与酶可逆偶联的官能团，该酶包含在细胞块中。从细胞块中分出PEG和酶的共轭物，如果需要，然后从PEG衍生物上分出酶。在另外的例子中，需要使PEG衍生物(“聚乙二醇化”)偶联来克服在临床中使用生物活性分子时所遇到的障碍。公开的PCT公开号WO92/16221中描述：例如，已发现许多具有有效治疗作用的蛋白质在血清中的半衰期短。就绝大部分而言，通过肾脏将蛋白质从血液中清除了。系统摄入较多的蛋白质(特别是人系统之外的那些蛋白质)时，会产生免疫反应，这样可导致通过形成免疫复合物而从体内快速排斥该蛋白质。对于其它蛋白质来说，溶解性和凝集问题也妨碍了蛋白质的最佳配制。聚乙二醇化通过增加分子的表观分子量来减小从血液中的清除速率。对于一定大小的分子来说，蛋白质滤过肾小球的速率与蛋白质大小成反比。所以聚乙二醇化减小清除的能力通常不是吸附在蛋白质上PEG基团多少的函数，但与改变的蛋白质的总分子量有关。清除速率的减小可使功效比非聚乙二醇化的物质有所增加。如参见Conforti等，药物研究通信第19卷，287页(1987)和Katre等，美国国家科学院院刊，第84卷，1487页(1987)。-->另外，聚乙二醇可减小蛋白质的凝集作用(Suzuki等，生物化学与生物物理学报第788卷，248页(1984))，改变蛋白质的免疫原性(Abuchowski等生物化学杂志，第252卷，3582页(1977))，并增加蛋白质的溶解性，如在PCT公开号WO 92/16221中所述。蛋白质的聚乙二醇化说明了在将PEG吸附在表面和分子上时所遇到的一些问题。绝大多数聚乙二醇化试剂与多肽中游离的伯胺基进行反应。大多数这样的游离胺是赖氨酸残基的ε氨基。通常的蛋白质含有大量的赖氨酸。其结果是，随机吸附多个PEG分子而常常使蛋白质失活。另外，如果打算将聚乙二醇化的蛋白质用于治疗，由非特异的聚乙二醇化所产生的多种物质混合物导致难以制备具有再现性和可定性的产物。这种非特异性的聚乙二醇化使得难以评价其治疗作用，也难以建立其效能和剂量信息。该类蛋白质位点选择性聚乙二醇化可产生再现性修饰的物质，获得所需的PEG化而没有失活。对再现性地生产连接两个或多个生物活性分子或化合物的复合物的需求也是存在的。在某些情况下，使用含有多于一个的生物活性多肽或药物的多聚体(multimeric)复合物产生协同性的有益作用。例如，与单体(monomeric)多肽相比，含有两个或多个相同结合多肽的复合物与配体或活性部位的亲和性可有很大增加。另外，含有(1)在体内的特定部位起作用的生物活性蛋白质和(2)可将复合物导向特定部位的分子可能是特别有利的。对水解稳定的激活的聚合物也存在着需要，该聚合物形成水解稳定的键。否则的话，在某些情况下，所需反应进行之前活性基团失活或反应后所形成的共轭物在水性介质(如血液或血浆)中半衰期短。例如，Zalipsky的美国专利5122614描述用氧羰基-N-二甲酰亚氨(oxycarbonyl-N-dicarboximide)官能团活化的PEG分子可在水性碱性条件下通过尿烷键合被结合到多肽的氨基上。表明活化的PEG-N-琥珀酰亚胺碳酸盐与胺基形成稳定的水解耐受的尿烷键。显示胺基在约8.0到9.5的碱性pH下反应性更强，而在低pH下，反应活性急剧下降。然而在pH8.0到9.5时，未偶联的PEG衍生物的水解也急剧增加。Zalipsky通过使用过量的PEG衍生物与蛋白质结合来避免未偶联PEG衍生物与水反应速率增加的问题。通过使用过量的PEG衍生物，在PEG衍生物水解和不能反应之前，将足量的活性氨基部位结合到PEG上来修饰蛋白-->质。    Zalipsky的方法足以将蛋白质的赖氨酸部分非特异性地连接到PEG衍生物的PEG上的一个活性部位。然而，如果PEG衍生物的水解速率大时，可产生与PEG分子上的多个反应部位结合的问题，因为简单的过量不减慢水解的速度。例如，在每个末端具有活性部位的线性PEG在一个末端与蛋白质结合而另一末端的反应部位可与水反应形成较不活泼的羟基部分而未使PEG连接两个蛋白质。如果需要将一个分子通过PEG连结剂偶联到表面上，出现类似的问题，因为PEG首先与表面连结或偶联到分子上，并且PEG衍生物的另一端必须保持活性以便随后进行反应。如果有水解问题，那么另一端通常是失活的。Zalipsky的美国专利5122614也描述了由先有的专利获得的一些其它PEG衍生物。表明PEG-琥珀酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯形成限制水介质中稳定性的酯键。表明PEG-氰尿酰氯是有毒的并与可导致蛋白质失活的蛋白质上的特定官能基发生非特异性反应。PEG-苯基碳酸酯产生有毒的疏水性苯酚残基，该残基对蛋白质有亲和性。用羰基二咪唑(carbonyldiimidizole)活化的PEG在与蛋白质官能基反应时非常缓慢，需要长的反应时间来获得足够修饰的蛋白质。已提出其它与非赖氨酸ε氨基官能基连结的PEG衍生物。例如，马来酰亚胺特异于半胱氨酸的巯基但马来酰亚胺官能度易于水解。因此，需要存在再现性地产生其各部分由非抗原性的高度溶解的生物惰性分子连结的分子的试剂和方法。本专利技术满足了对此复合物的需求并产生了相关的优点。本专利技术也满足了对形成水解稳定性共轭物所需的水解稳定性试剂的需求。专利技术概述本专利技术涉及生物活性的共轭物，它含有具有反应性硫羟部分的生物活性分子和具有与反活应硫羟部分形成键的活性砜部分的非肽聚合物。生物活性分子可以是合成的，天然产生的或修饰天然产物获得的分子。可将拥有所需生物活性的分子修饰为含有反应性硫羟部分的。特别有用的生物活性分子包括肿瘤坏死因子(“TNF”)抑制剂，白细胞介素-1受体拮抗剂(“IL-lra′s”)，CR1，PDGF的外显子6肽和白细胞介素-2(“IL-2”)抑制剂和受体(“IL-2r”)。-->本专利技术聚合物含有至少一个活性砜部分并具有式P-SO2-C-C*-，其中P为聚合物且C*为与硫羟部分键合的反应性部位。硫羟和活性砜的连结之处为C*，且可用式P-SO2-C-C*S-R来表示，其中R为生物活性分子。有用的活性砜部分包括，如，乙烯砜和氯乙基砜。各种聚合物可被活化用于本专利技术的所有实施方案中，包括水溶性聚合物如聚乙二醇(“PEG”)和相关的亲水性聚合物。本专利技术也提供用砜活化的聚合物来制备上文所述生物活性共轭物的方法。该方法包括下列步骤：(a)将具有反应性硫羟部分的生物活性分子与具有活性砜部分的非肽聚合物反应而形成共轭物；和(b)分离该共轭物。含有该共轭物的药物组合物也在本专利技术的范围之内。本专利技术还涉及用于偶联各本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物活性轭合物，它含有：选自ＩＬ－１抑制剂、肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）抑制剂、ＣＲ↓［１］、ＰＤＧＦ受体、ＩＬ－２和ＰＤＧＦ的外显子６肽的生物活性分子，其中所述生物活性分子具有反应性硫羟基部分，和具有与所述硫羟基部分形成键的活性砜部 分的非肽聚合物。

【技术特征摘要】
US 1994-6-14 08/259,4131.一种生物活性轭合物，它含有：选自IL-1抑制剂、肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂、CR1、PDGF受体、IL-2和PDGF的外显子6肽的生物活性分子，其中所述生物活性分子具有反应性硫羟基部分，和具有与所述硫羟基部分形成键的活性砜部分的非肽聚合物。2.权利要求1的生物活性轭合物，其中所述活性砜部分为乙烯砜。3.权利要求1的生物活性轭合物，其中所述活性砜部分为氯代乙基砜。4.权利要求1的生物活性轭合物，其中所述生物活性分子为选自30kDa TNF抑制剂、40kDa TNF抑制剂、Δ51 TNF抑制剂和Δ53 TNF抑制剂的TNF抑制剂。5.权利要求4的生物活性轭合物，其中所述TNF抑制剂为30kDaTNF抑制剂。6.权利要求4的生物活性轭合物，其中所述TNF抑制剂为40kDaTNF抑制剂。7.权利要求4的生物活性轭合物，其中所述TNF抑制剂为Δ51 TNF抑制剂。8.权利要求4的生物活性轭合物，其中所述TNF抑制剂为Δ53TNF抑制剂。9.权利要求1的生物活性轭合物，其中所述生物活性分子为白细胞介素-1(IL-1)抑制剂。10.权利要求9的生物活性轭合物，其中所述IL-1抑制剂为白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-lra)。11.权利要求1的生物活性轭合物，其中所述非肽聚合物除所述活性砜部分外还具有反应性NHS-酯。12.权利要求11的生物活性轭合物，其中所述活性砜部分为乙烯砜。13.一种基本上纯化的式R1-X-R2的化合物，其中：X含有具有第一反应性基团和第二反应性基团的非肽聚合物，其中所述第一反应性基团为迈克尔受体；R1含有选自IL-1抑制剂，肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂、CR1、PDGF受体、IL-2和PDGF的外显子6肽的生物活性分子，该分子具有反应性硫羟部分，将所述生物活性分...

【专利技术属性】
技术研发人员：甲野忠彦，D卡兴斯基，M哈里斯，
申请(专利权)人：希尔沃特聚合物公司，安姆根博尔德有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]