可用作疫苗的自装配肽纳米颗粒制造技术

描述了掺入Ｔ－和／或Ｂ－细胞表位的自装配肽纳米颗粒（ＳＡＰＮ）。本发明专利技术的纳米颗粒由连续肽链的聚集体组成，所述连续肽链包含通过连接区段相连的两个寡聚化结构域，其中一个或两个寡聚化结构域在它们的肽序列中掺入Ｔ－和／或Ｂ－细胞表位。这些纳米颗粒可用作疫苗的和佐剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及掺入B-细胞表位和/或T-细胞表位的自装配肽纳米颗粒。此外，本 专利技术涉及这样的纳米颗粒用于疫苗接种的用途。
技术介绍
适应性免疫系统具有两类不同的应答，体液免疫应答和细胞免疫应答。第一类的 特征在于抗体应答，其中这些抗体结合病原体的表面表位，而第二类的特征在于细胞毒性 的T-淋巴细胞(CTLs)，它们杀死已经被感染的细胞。两类免疫应答进一步受到T-辅助细 胞的刺激，后者会激活生产结合特定病原体的抗体的B-细胞或针对受感染的细胞的T-细 胞。B-细胞生产的抗体和病原体之间相互作用的特异性，由病原体的表面结构(所谓 的B-细胞表位)决定，而CTLs与受感染的靶细胞的相互作用的特异性，是借助于靶细胞 的表面分子上存在的T-细胞表位，所谓的主要组织相容性复合物I类分子(MHC I)。这类 T-细胞表位(CTL-表位)是由受感染的细胞生产的来自病原体的蛋白的片段。最后，T-辅 助细胞与各个B-细胞或CTL的相互作用的特异性，由T-辅助细胞的受体分子与B-细胞或 CTL-细胞上的MHC II类分子(MHC II)呈递的其它类型T-细胞表位(HTL-表位)的结合 来决定。抗体与B-细胞表位的结合需要B-细胞表位呈现特定的三维结构，该B-细胞表位 在它的天然环境中(即当它是在病原体的表面时)具有相同的结构。B-细胞表位可以由超 过一条肽链组成，它的三维结构由蛋白支架来组织。但是，T-细胞表位不需要特定的三维结构，各个MHC I或MHC II分子以非常特异 性的方式结合它们。为了最佳呈递，MHC I分子把CTL表位修剪成长度为9个氨基酸的大 小，而HTL表位与MHC II分子发生类似的相互作用，但是可能比仅9个氨基酸更长。在本 专利技术的上下文中，重要的是，表位与MHC分子的结合，遵循非常特殊的规则，即仅具有特定 特征的肽能结合各个MHC分子，并从而用作表位。这些特征已经得到彻底研究，且从已知的 表位知识，已经开发出预测程序，其能高准确度地预测能结合MHC分子的表位。现在正在构 建在线性肽链中由几个这样的T-细胞表位组成的肽串作为疫苗候选物。原则上，有效的疫苗应当诱导强烈的体液免疫应答以及强烈的细胞免疫应答。已 经证实，通过B-细胞表位的重复抗原显示，可以实现强烈的体液免疫应答。病毒样颗粒 (VLPs)可以用作有效的工具，以规则的、重复的和严格的方式呈递B-细胞表位，因此VLPs 现在广泛地用于疫苗设计。在专利EP 1 594 469 Bl中，已经描述了重复抗原显示的另一 个方案。在该专利中，已经构建出由三聚体和五聚体蛋白寡聚化结构域组成的自装配肽纳 米颗粒(SAPN)，它们在表面上重复显示B-细胞表位。B-细胞表位结合在寡聚化结构域的 末端，以便确保B-细胞表位以多个拷贝呈递在纳米颗粒表面。最常遇到的蛋白寡聚化基序 之一是卷曲螺旋结构基序，该基序可以有效地用于这些SAPN的设计中。
技术实现思路
本专利技术涉及掺入T-和/或B-细胞表位的自装配肽纳米颗粒(SAPN)。更具体地， 本专利技术的纳米颗粒由连续肽链的聚集体组成，所述连续肽链包含通过连接区段相连的两个 寡聚化结构域，其中一个或两个寡聚化结构域是在它的肽序列中掺入T-和/或B-细胞表 位的卷曲螺旋。本专利技术另外涉及使用这样的掺入T-和/或B-细胞表位的自装配肽纳米颗粒免疫 接种人或非人动物的方法。附图说明图1 共价连接卵白蛋白肽(0VA323-339)的小鼠MHC II分子I-Ad的结构，它是 I-Ad的HTL表位。从顶部以C-α示踪，将MHC II蛋白显示为灰色。形成表位结合部位的 壁的2个螺旋侧接结合的肽。肽在全原子球棍模型中显示为黑色。结合形式的肽HTL表位 是处于展开构象中，这可以通过图底部单独肽的结构更清楚地看到。图2 分别是三聚体和五聚体寡聚化结构域和三聚体和四聚体寡聚化 结构域的"均勻单元"的示意图。单体(构造块)的数目由构造块的两个寡 聚化结构域Dl和D2的寡聚化状态的最小公倍数(LCM)决定。在均勻单元中，所有构造块 的连接区段彼此尽可能近地排列，即尽可能接近肽纳米颗粒的中心，因此均勻单元会自装 配成球形纳米颗粒。图3 十二面体/ 二十面体的内部对称性元件。旋转对称轴(2-倍、3-倍和5-倍) 显示为标有2、3和5的线。在A)中，显示了由寡聚化结构域Dl (左边，具有3倍对称的卷曲 螺旋结构域)、连接区段L (底部)和寡聚化结构域D2 (右边，具有5倍对称的卷曲螺旋结构 域)组成的单体构造块，使得寡聚化结构域Dl和D2的内部对称性元件在多面体的对称元 件上重叠。在B中)，显示了完整的卷曲螺旋结构域Dl和D2。由多面体的3-倍和5-倍旋 转对称元件产生的其它对称对象显示为圆柱体，而起始分子显示为象在A)中一样的螺旋。图4 实施例1中从具有序列SEQ ID NO 8的肽制备的自装配的肽纳米颗粒的动态 光散射(DLS，A)和透射电子显微术(TEM，B)。DLS分析显示出平均粒径为32. Olnm的大小分 布，多分散性指数为12.9% (A)。TEM照片⑶显示出与通过DLS测得相同大小的纳米颗粒。图5 实施例2中从具有序列SEQ ID NO 10的肽制备的自装配的肽纳米颗粒的透 射电子显微术(TEM)。TEM照片显示出25nm相同大小的纳米颗粒。图6 实施例3中从具有序列SEQ ID NO 12的肽制备的自装配的肽纳米颗粒的透 射电子显微术(TEM)。TEM照片显示出约20至30nm大小的纳米颗粒。图7 用于人和鸡流感疫苗的从分别具有序列SEQ ID NO :37(小图A)和SEQ ID N0:38(小图B)的肽制备的自装配的肽纳米颗粒(实施例9)的透射电子显微术(TEM)。TEM 照片显示出约25nm大小的纳米颗粒。图8 实施例11中从具有序列SEQ ID NO 41的肽制备的自装配的肽纳米颗粒的 透射电子显微术(TEM)。TEM照片显示出约25nm大小的纳米颗粒。专利技术详述单体构造块自装配肽纳米颗粒(SAPN)由多个式⑴的单体构造块制成，所述式⑴的单体构造块由包含肽寡聚化结构域D1、连接区段L和肽寡聚化结构域D2的连续链组成，D1-L-D2(I),其中Dl是合成的或天然的肽，其具有形成m个亚基Dl的寡聚体(Dl)mW倾向，D2 是合成的或天然的肽，其具有形成η个亚基D2的寡聚体(D2) η的倾向，m和η各自是2至10 之间的数字，条件是，m不等于n，且m不是η的倍数，且η不是m的倍数，L是键或选自下述 的短连接链任选取代的碳原子、任选取代的氮原子、氧原子、硫原子、和它们的组合；Dl或 D2中的任一个或Dl和D2两者是在寡聚化结构域中掺入一个或更多个T-和/或B-细胞表 位的卷曲螺旋，且其中D1、D2和L任选地被进一步取代。肽(或多肽)是通过酰胺键共价连接的氨基酸的链或序列。肽可以是天然的、修 饰的天然的、部分合成的或完全合成的。“修饰的天然的、部分合成的或完全合成的”应当 理解为，表示不是天然存在的。术语氨基酸包括，选自20种必需的天然的α-L-氨基酸的 天然存在的氨基酸，合成的氨基酸，例如α-D-氨基酸、6-氨基己酸、正亮氨酸、高半胱氨酸 等，以及已经以某些方式进行修饰来改变某些性质(例如电荷)的天然存在的氨基酸，例如 磷酸丝氨酸或磷酸酪本文档来自技高网...

【技术保护点】
由多个式（Ⅰ）构造块的聚集体组成的自装配肽纳米颗粒，所述式（Ⅰ）构造块由包含肽寡聚化结构域Ｄ１、连接区段Ｌ和肽寡聚化结构域Ｄ２的连续链组成，　　Ｄ１－Ｌ－Ｄ２　（Ⅰ），　　其中Ｄ１是其具有形成ｍ个亚基Ｄ１的寡聚体（Ｄ１）ｍ的倾向的肽，Ｄ２是具有形成ｎ个亚基Ｄ２的寡聚体（Ｄ２）ｎ的倾向的肽，ｍ和ｎ各自是２至１０之间的数字，条件是，ｍ不等于ｎ，且ｍ不是ｎ的倍数，且ｎ不是ｍ的倍数，Ｌ是键或短连接区段，Ｄ１或Ｄ２中的任一个或Ｄ１和Ｄ２两者是在寡聚化结构域中掺入一个或更多个Ｔ－和／或Ｂ－细胞表位的卷曲螺旋，且其中Ｄ１、Ｄ２和Ｌ任选地被进一步取代。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P布克哈德，
申请(专利权)人：阿尔法O肽股份公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]