本发明专利技术提供了一种生产香紫苏醇的方法，所述方法包括使具有香紫苏醇合酶活性的特定多肽与焦磷酸赖百当烯二醇酯（ＬＰＰ）接触。具体而言，所述方法可以在体外或体内进行以生产香紫苏醇，这是一种在香料和调味料领域非常有用的化合物。本发明专利技术还提供在该方法中使用的多肽的氨基酸序列。源自快乐鼠尾草（Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａ）并编码本发明专利技术多肽的核酸，含所述核酸的表达载体，以及经转化以包藏同一核酸的非人生物体或细胞也是本发明专利技术的一部分。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了一种，所述方法包括使具有香紫苏醇合酶活 性的特定多肽与焦磷酸赖百当烯二醇酯(LPP)接触。具体而言，所述方法可以在体外或 体内进行以生产香紫苏醇，这是一种在香料和调味料领域非常有用的化合物。本专利技术还 提供在该方法中使用的多肽的氨基酸序列。源自快乐鼠尾草并编码本专利技术多肽的核酸， 含所述核酸的表达载体，以及经转化以包藏同一核酸的非人生物体或细胞也是本专利技术的 一部分。
技术介绍
香紫苏醇是类萜或萜家族中的一员，其包含高含量的天然产物。萜见于大多数 生物体(微生物、动物和植物)。这些化合物由称为异戊二烯的五碳单元构成，并由其 结构中存在的这些单元的数目来划分。因此，单萜、倍半萜和二萜分别为含10、15和 20个碳原子的萜。二萜例如可广泛见于植物界，并且已描述了超过2500种的二萜构造 (Connolly and Hill, Dictionary of terpenoids, 1991, Chapman &Hall，London)。蔽分子由 于其风味和香味特性以及其化妆、医药和抗微生物效果，一直是数千年来的兴趣所在。 由例如蒸汽蒸馏或溶剂提取等各种手段获得的植物提取物被用于萜的来源。萜分子通常 原样使用，但在某些情况下利用化学反应来将萜转化为其他高价值分子。萜的生物合成生产涉及被称为萜合酶的酶。这些酶将前体转化为一种或多种萜 产物。通常，该前体是非环状萜前体，特别地，大多数二萜合酶对非环状前体焦磷酸香 叶基香叶酯的环化起催化作用。然而，在某些特殊情况下，萜合酶催化由已环化分子至 一种或多种萜产物的转变。自然界存在两种类型的环化机理，它们与可分为I类二萜合酶和II类二萜合酶的 两种类型的二萜合酶有关(Wendt and Schulz，1998，Structure.6 (2) 127-33)。对于某些 二萜来说，其环化机理与单萜和倍半萜的环化机理类似，其自GGPP的焦磷酸酯的酯官 能的离子化起始，接着是所得碳阳离子与内部双键的反应。催化这种类型环化的二萜合 酶为I类二萜合酶。二萜的生物合成中由II类二萜合酶催化的第二种环化模式由GGPP 的端末双键的质子化起始，并在内部重排和质子消除之后，产生环状二萜焦磷酸酯中间 体。编码来自两类中每种二萜合酶的基因和CDNA已被克隆出，并且重组酶也已鉴 定。编码不同类型二萜合酶的基因的可获性为酶的一级结构提供了信息。某些氨基酸基 序在二萜合酶中保留下来，并且要么与依赖质子化的环化相关，要么与依赖离子化的环 化相关。DDxxD基序见于一些I类二萜合酶。所述基序很可能参与焦磷酸酯部分的连接 和离子化。在II类合酶中发现了保守的DxDD，其中涉及第二天冬氨酸残基作为质子供 体。香紫苏醇是天然产生的二萜分子，其广泛用作用于合成带有龙涎香香调的芳香 分子的起始材料。开发这类合成用于提供龙涎香——由抹香鲸的肠分泌的一种蜡状物质——的代用品。龙涎香由于其令人愉快的气味而备受赏识，并且在历史上已被用作加 香成分。由于龙涎香高昂的价格以及日益增长的需求，并且特别是由于对鲸类的保护， 已经开发了带有龙涎香特征的龙涎香成分和分子的化学合成。在这些分子中，Ambrox (瑞士 Firmenich SA的注册商标)是最受大多数人赏识的龙涎香的代用品。用于Ambrox 合成的最广泛使用的起始材料是二萜二醇香紫苏醇。通常，植物天然提取物的价格和可获性取决于该植物的丰度、油的收率以及地 理来源。此外，天然提取物的可获性和品质极大地依赖于导致每年差异化的气候和其他 地区条件，使得在某些年份在高品质香料中使用这些成分非常困难，甚至于不可能。因 此，提供极少受可获性和品质的波动影响的香紫苏醇来源是有利的。但是，考虑到其高 度复杂的结构，制备香紫苏醇的经济的合成方法依旧是困难的。由此，能够合成香紫苏 醇的生物化学路径将引起极大的兴趣。在植物和其他生物体中进行的萜的生物合成早已广泛研究，在此不赘述，但可 参考Dewick，Nat.Prod.Rep., 2002，19，181-222，其回顾了萜的生物合成路径的现有技 术状况。一些二萜合酶早已被鉴定出。具体而言，US 7,238,514公开了若干二萜合酶， 编码它们的核酸，以及单细胞生物体，其经转化以表达这些合酶中的每一种连同GGPP 合酶，由此在体内生产二萜。尽管如此，在该专利中并未具体公开如本文所提供的使用 具有香紫苏醇合酶活性的多肽来进行香紫苏醇的生物合成的方法。在该专利中公开的 氨基酸和核苷酸序列与本专利技术的序列极为不同。在该文献中描述的二萜合酶中，与本 专利技术的多肽最接近的为用于对映体贝壳杉烯(ent-kaurene)合酶的黄瓜(Cucumis sativus) mRNA,在US 7,238,514中标识为SEQIDNO 389，以及用于对映体贝壳杉烯合酶B的 笋瓜(Cucurbita maxima) mRNA,在 US7,238,514 中标识为 SEQ ID NO 395，其编号为 AAB39482.1。这些多肽与本专利技术的多肽仅有32%的同一性。此外，在该现有技术文献 中没有暗示所描述的二萜合酶能用于生产香紫苏醇。与本专利技术的序列具有一定百分比的序列同一性的萜合酶还见于序列数据库。 尽管如此，已知的二萜合酶与本专利技术的多肽之间的同一性百分比非常低。与本专利技术 最接近的合酶为与本专利技术的多肽具有36%同一性的不确定功能的类萜环化酶(编号 为NCBIAAS98912)，与本专利技术的多肽具有32 %同一性的黄瓜(Cucumis sativus)的对 映体贝壳杉烯合酶(编号BAB 19275)，与本专利技术的多肽具有32 %同一性的来自水稻 (Oryzasativa)的对映体咖萨二烯(ent-cassadiene)合酶(编号 ABH 10734,公布于 Xu， Wilderman, Morrone, Xu, Roy, Margis-Pinheiro, Upadhyaya, Coates and Peters, Functional characterization of the rice kaurene synthase-like gene family, Phytochemistry, 68(3)，2007，312-326)以及与本专利技术的多肽具有32%同一性的来自水稻(Oryza sativa) 的对映体贝壳杉烯合酶(编号AAQ72559，公布于Margis-Pinheiro，Zhou, Zhu， Dennis and Upadhyaya, Isolation and characterization of a DS-tagged rice (Oryza sativa L.) GA-responsive dwarimutant defective in an early step of the gibberellins biosynthesis pathway, Plant Cell Rep.，23(12)，2005，819-833)。在该现有技术中从未提及这些序列中的任一 种具有催化香紫苏醇生产的潜在能力。除序列本身之间的区别外，还需要指出的是，对映体贝壳杉烯和对映体咖萨二烯的结构和性质与香紫苏醇极为不同。具体而言，对映体贝壳杉烯是本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生产香紫苏醇的方法，包括：（ａ）使焦磷酸赖百当烯二醇酯（ＬＰＰ）与具有香紫苏醇合酶活性的多肽接触，该多肽包含与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１有至少７０％同一性的氨基酸序列；并且（ｂ）非强制性选择地将步骤（ａ）中生产的香紫苏醇分离。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2008-1-29 08101075.3;EP 2008-3-17 08102661.9;EP1.一种生产香紫苏醇的方法，包括(a)使焦磷酸赖百当烯二醇酯(LPP)与具有香紫苏醇合酶活性的多肽接触，该多肽包 含与SEQ ID NO 1有至少70%同一性的氨基酸序列；并且(b)非强制性选择地将步骤(a)中生产的香紫苏醇分离。2.权利要求1的方法，其中所述多肽包含与SEQID NO: 1有至少80%，更优选至少 90%同一性的氨基酸序列。3.权利要求2的方法，其中所述多肽包含SEQID NO: 1所规定的氨基酸序列。4.权利要求3的方法，其中所述多肽由SEQIDNO: 1所规定的氨基酸序列组成。5.权利要求1 4中任一项的方法，其中步骤(a)通过在有助于香紫苏醇生产的条件 下培养能生产LPP并经转化以表达所述多肽的非人生物体或细胞而进行。6.权利要求5的方法，还包括在步骤(a)之前，用编码所述多肽的核酸来转化该能生 产LPP的非人生物体或细胞，从而所述生物体表达所述多肽。7.权利要求5或6的方法，其中所述非人生物体是植物、原核生物或真菌。8.权利要求5或6的方法，其中所述非人生物体是微生物。9.权利要求8的方法，其中所述微生物是细菌或酵母。10.权利要求9的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(E.coli)，所述酵母是酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。11.权利要求5或6的方法，其中所述非人细胞是从植物细胞或真菌细胞中选出的高 等真核细胞。12.分离的多肽，该多肽具有香紫苏醇合酶活性并包含与SEQIDNO : 1有至少70% 同一性的氨基酸序列。13.权利要求12的分离的多肽，该多肽包含与SEQID NO : 1有至少80%，更优选至 少90%同一性的氨基酸序列。14.权利要求13的分离的多肽，该多肽包含SEQID NO: 1所规定的氨基酸序列。15.权利要求14的分离的多肽，该多肽由SEQID NO: 1所规定的氨基酸序列组成。16.权利要求12 15中任一项的分离的多肽，该多肽源自快乐鼠尾草(Salvia Sclarea)。17.分离的核酸，其编码权利要求12 16中任一项的多肽。18.权利要求17的分离的核酸，该核酸包含与SEQID NO 2有至少70%同一性的核 苷酸序列或其补体。19.权利要求18的分离的核酸，该核酸包含与SEQID NO 2有至少80%，优选至少 90%同一性的核苷酸序列或其补体。20.权利要求19的分离的核酸，该核酸包含与SEQID NO 2相...
【专利技术属性】
技术研发人员：M沙尔克，
申请(专利权)人：弗门尼舍有限公司，
类型：发明
国别省市：CH
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