人化抗－人ＮＫＧ２Ａ单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及为ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受体的非竞争性拮抗剂的试剂，例如某些抗－ＮＫＧ２Ａ抗体，特别是人化形式的鼠抗－ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ１９９，以及生产和使用所述试剂和抗体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及⑶94/NKG2A受体的非竞争性拮抗剂，包括某些抗-NKG2A抗体，特别是 鼠抗-NKG2A抗体Z199的人化形式，以及生产和使用所述抗体的方法。
技术介绍
⑶94/NKG2A是发现于天然杀伤细胞(NK细胞)，天然杀伤T细胞(NKT细胞)和T 细胞(α/β和γ/δ)的亚组的抑制受体。⑶94/NKG2A限制前述淋巴细胞对表达⑶94/ NKG2A-配体HLA-E的细胞的细胞因子释放和细胞毒性应答(见例如，W099/28748)。还发 现HLA-E被某些肿瘤细胞(Derre et al.，JImmunol 2006 ；177 :3100_7)和活化的内皮细 胞(Coupel et al.，Blood 2007 ； 109 :2806_14)以可溶形式分泌。抑制 CD94/NKG2A 信号传 导的抗体可能提高淋巴细胞对HLA-E阳性靶细胞的细胞因子释放和溶胞活性，例如CD94/ NKG2A阳性肿瘤特异性T细胞对表达HLA-E的肿瘤细胞的应答，或对病毒感染细胞的NK应 答。因此，抑制⑶94/NKG2A而不刺激杀伤表达⑶94/NKG2A细胞的治疗性抗体(即，非衰竭 性抗体(non-d印leting antibody))可能在癌症患者中诱导肿瘤生长的控制。另外，某些淋巴瘤例如，NK-淋巴瘤，特征为⑶94/NKG2A表达。在所述患者中，靶 向和杀伤表达⑶94/NKG2A的细胞的治疗性抗体(S卩，耗竭性抗体)可能能够通过抗体依赖 性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)根除肿瘤细胞。抗-NKG2A抗体也已经被 建议用于治疗自身免疫或炎性疾病(见例如，US20030095965, W02006070286)。多种抗NKG2A抗体已在本领域中描述。例如，Sivori等人(Eur JImmunol 1996 ； 26 2487-92)提到鼠抗-NKG2A 抗体 Z270 ；Carretero 等人(EurJ Immunol 1997 ；27 :563_7) 描述鼠抗-NKG2A抗体Z199(现在可商业获得于Beckman Coulter, Inc.，产品号IM2750， USA) ；Vance 等人(J Exp Med 1999 ； 190 1801-12)提到大鼠抗-鼠 NKG2-抗体 20D5 (现在 可商业获得于BD Biosciences Pharmingen，目录号.550518，USA)；和美国专利申请公开 20030095965描述了鼠抗体3S9，其据称结合于NKG2A，NKG2C和NKG2E。目前可获得的抗-CD94/NKG2A抗体是非人源的，由于它们的免疫原性，这使得它 们不适于大多数在人中的治疗应用。相应地，需要适于治疗人患者的抗-CD94/NKG2A抗体。专利技术概述本专利技术提供了 NKG2A结合试剂，例如抗-NKG2A抗体，以及包含所述试剂的组合物， 和生产和使用所述试剂的方法。所述试剂典型地是人CD94/NKG2A受体的非竞争性拮抗剂， 并且降低所述受体的抑制活性而不阻断它的配体，HLA-E的结合。在一个实施方式中，所述 试剂是如下抗体，所述抗体以比与NKG2C显著更高的亲合力结合NKG2A，并且结合包含残基 P94-N107和/或M189-E197的NKG2A区段，或两种区段。在另外的或替代的实施方案中，所 述试剂与鼠抗-NKG2A抗体Z 199竞争与CD94/NKG2A的结合。所述试剂可以是，例如，人或 人化的抗-NKG2A抗体。在一个实施方式中，所述人化抗体是人化形式的Z199。提供了所述具有改善的性 质的人化抗体的示例性的互补决定区(CDR)残基或序列和/或用于在框架区(FR)的氨基 酸取代的位点，所述改善性质例如，更低的免疫原性，改善的抗原结合或其他功能性质，和/或改善的物理化学性质例如，更好的稳定性。在一个方面，本专利技术提供了人化抗体，其中 Z199Kabat⑶R的至少一部分与人接纳体(acceptor)序列的相应部分同一。在一个实施方 式中，人框架序列包含至少一个回复突变，例如，1，2，3，4，5或6个回复突变。在另一实施方 式中，可变轻(VL)结构域的人框架序列包含单个回复突变。在其他方面，本专利技术提供了药物组合物，其包含所述试剂和载体，还提供了缀合 物，其包含缀合于例如细胞毒性或可检测试剂的所述试剂。在其他方面，本专利技术提供了编码所述试剂的核酸和载体，以及包含所述核酸和/ 或载体的宿主细胞。还提供了通过培养所述宿主细胞以生产所述核酸来生产所述试剂的重 组方法。在其他方面，本专利技术提供了制备的物品，其包含容器，所述容器包含所述试剂和指 示使用者治疗患者中的病症例如癌症或病毒疾病的说明书。任选地，物品可包含另一容器， 所述容器包含另一试剂，其中说明书指示使用者利用抗体与该试剂联合治疗病症。本专利技术还提供了将所述本专利技术的试剂用于治疗患者中的病症的方法，所述病症例 如癌症，病毒性疾病，炎性病症或自身免疫病症，任选地，与另一抗癌症，抗病毒性疾病试 剂，或抗炎性试剂联合。附图描述附图说明图1显示了 Cr-51释放测定的结果，其评价表达⑶94/NKG2A的NKL细胞杀伤表 达或缺乏功能性HLA-E的靶细胞的能力，以及鼠抗体HP-3D9 (A)(抗-CD94)或Z199(B) (抗-NKG2A)对表达HLA-E的靶细胞的杀伤的效果。NKL细胞有效地杀伤缺乏功能性HLA-E 的Cr-51-标记的靶细胞，而表达功能性HLA-E的靶细胞被较不有效地杀伤。当NKL细胞与 Z199预孵育时，表达HLA-E的靶细胞与缺乏HLA-E的靶细胞同样好地被杀伤，证实了 Z199 功能性地抑制⑶94/NKG2A。图2显示了 Biacore实验，其中与HLA-E四聚物预孵育的单链⑶94/NKG2A Fc (scCD94-NKG2A-Fc)构建体可结合Z199,而HP-3D9被防止结合。图3显示了过表达CD94/NKG2A的Ba/F3细胞结合HLA-E四聚物，HP-3D9，和Z199， 如通过流式细胞术所评价的。当与Z199预孵育时，Ba/F3-⑶94/NKG2A细胞仍然可结合 HLA-E四聚物，而当与HP-3D9预孵育时不结合。图4显示了对于Z199的VL(SEQ ID NO 2)禾口 VH(SEQ ID NO 4)序列的人化的序 列分析。在显示根据Kabat方案的残基编号的第一行中，用下划线显示掩蔽(mask)，并且 Kabat⑶R以粗体显示。在种系序列中，用灰色背景给出小鼠/人种系差异(VKIII_L6/JK2 SEQ IDNO 12 ；VH3_21/JH3 :SEQ ID NO 14)。给出了对于人化Z199 (humZ199)的 VL(SEQ ID NO 13)和VH(SEQ ID NO 15)区产生的序列，作为人的潜在回复突变残基以粗体和下划线 表不。图5显示了具有在轻链中的回复突变E1Q，L46P，L47W，I58V或D70S的humZ199变 体在Biacore中的结合概况。而重组表达的亲本鼠抗体Z199 (rec)和具有人IgG4 (S241P) 部分的嵌合Z199 (chim)有效地结合sc⑶94/NKG2A-FC，没有任何回复突变的人化 Z199 (hum)具有结合sc本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的人或人化抗－ＮＫＧ２Ａ抗体，其　　（ａ）结合在表达ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ的淋巴细胞的表面上表达的人ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受体的细胞外部分；　　（ｂ）降低人ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受体的抑制活性；和　　（ｃ）不与ＨＬＡ－Ｅ竞争与人ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受体的结合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2008-1-24 08150601.6分离的人或人化抗 NKG2A抗体，其(a)结合在表达CD94/NKG2A的淋巴细胞的表面上表达的人CD94/NKG2A受体的细胞外部分；(b)降低人CD94/NKG2A受体的抑制活性；和(c)不与HLA E竞争与人CD94/NKG2A受体的结合。2.权利要求1的抗体，其与⑶94/NKG2A结合的KD为与人⑶94/NKG2C的至多1/100。3.任一项前述权利要求的抗体，其与Z199抗体竞争与人CD94/NKG2A受体的结合。4.任一项前述权利要求的抗体，其与Z199抗体结合相同的表位。5.任一项前述权利要求的抗体，其结合包含残基P94-N107，M189-E197，或两者的 NKG2A(SEQ ID NO 11)的区段。6.任一项前述权利要求的抗体，其结合包含选自NKG2A(SEQIDNO 11)的P94，S95， T96，L97，198，Q99，R100，H 101，L 106，M 189，或 E197，或其任何组合的残基的表位。7.任一项前述权利要求的抗体，其为人化Z199抗体。8.权利要求7的抗体，包含Z199可变轻(VL)结构域(SEQID NO 2)的氨基酸残基 Y31, L49，和P94，和Z 199可变重(VH)结构域(SEQID NO 4)的氨基酸残基Y57，Y102，和 P103。9.权利要求7-8任一项的抗体，包含VL或VH结构域框架序列中的至少一个回复突变。10.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：PJL斯皮，J陈，SB帕德克耶尔，S景，J张，J余，
申请(专利权)人：诺沃诺迪斯克有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]