本发明专利技术提供一种特异性检测Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ的方法。本发明专利技术的Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ检测方法的特征在于，包括以下工序：（ａ）准备含有阴离子性平面型酞菁的溶液的工序；（ｂ）将含有上述阴离子性平面型酞菁的溶液与试样溶液混合的工序；和（ｃ）测定上述（ｂ）工序后的混合液在６４０～７４０ｎｍ的吸光度的工序。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及DNA的高级结构的检测方法以及利用该方法的诊断方法。
技术介绍
端粒是位于真核生物的染色体的两末端部分的由DNA和各种各样的蛋白质形成 的结构。根据迄今为止的研究，已知该端粒结构保护染色体不受某种DNA分解酶和不适当 的DNA修复等。另外，由于该端粒部分在每次细胞分裂后变短，所以认为其在称之为细胞老 化和永生化的现象中发挥重要作用。另一方面，如果从结构方面看，已知端粒具有几个特征。即，在大部分染色体DNA 中，在互补的双链DNA链之间，腺嘌呤(以下称为A)碱基和胸腺嘧啶(以下称为T)碱基、 鸟嘌呤(以下称为G)碱基和胞嘧啶(以下称为C)碱基分别形成特异的氢键从而形成 Watson-Crick型碱基对，并且通过在该碱基对之间产生的π - ji叠加相互作用而构建双螺 旋结构(图1)。但是，在端粒DNA中，虽然其大部分也由互补的双链DNA形成，但是，其最末端部分 DNA的3'末端突出(overhang 悬端)而形成单链状态。该悬端部分的长度和端粒的全长 根据物种而不同，人类的悬端部分为50 100个碱基左右，全长在初期阶段约为10000个 碱基对左右。而且，端粒序列的另一个结构特征为，悬端一侧的链由富含G的重复序列构 成，因此，作为其互补链的另一侧的链是富含C的重复序列。具体而言，人类的悬端一侧的链为5' -TTAGGG-3'(序列序号1)的重复序列 (富G序列)，另一侧为5' -CCCTAA-3'(序列序号1的反义链)的重复序列(富C序 列)。近年来，端粒部位中的富G序列得到特别热衷的研究。这是由于日益明确该序列 能够形成称为G-quadruplex的四链DNA结构。G-quadruplex (鸟嘌呤四链结构)中，已知 有四条DNA链全部为5'到3'方向的走向相同的平行型，或者两条走向相同而其余的两条 走向相反的反平行型等多种样式，但是每种样式都具有如图2所示的特征。S卩，四个G碱基 通过Hoogsteen型氢键形成称为G四联体(G-Quartet)的结构，并且该G四联体面之间通 过JI-JI叠加相互作用而保持该结构。另外，在形成G-quadruplex的结构时，在G四联体面和G四联体面之间需要金属 离子的配位，已知K离子和Na离子等进行配位。目前，这样的G-quadruplex在端粒内在什 么样的条件下形成，以及行使什么样的机能的详细内容仍不清楚。但是，认为其可能是与上 述的染色体保护和细胞老化等相关联的重要结构。另外，还日益明确如上所述的富G序列不仅存在于端粒中。例如，作为原癌基因的 c-myc中也存在形成G-quadruplex的富G序列。另外，除此以外，在c_kit、bcl_2、VEGF、 H-ras、N-ras基因的启动子区域中也发现有形成G-quadruplex的富G序列。这些都是与 细胞的癌化等相关联的基因，由此暗示G-quadruplex行使对人体重要的机能。因此，目前预测还存在超过30万个能够形成G-quadruplex的富G序列(以下，将这样的序列称为 Quadruplex预测序列)，它们在实际中是否形成G-quadruplex，若能形成，则这样的结构行 使什么样的机能备受瞩目。在这样的技术背景中，最重要的技术之一是特异性检测G-quadruplex的方法。 即，需要一种研究试样中的DNA是否含有G-quadruplex、或者试样中的由Quadruplex预测 序列构成的DNA在实际中能否形成G-quadruplex的技术。例如，如果对前者使用现有技 术进行研究，则如下所示。即，准备含有目的DNA的试样溶液，测定该溶液的CD (Circular Dichroism 圆二色性)谱。接着，根据所得到的⑶谱分析是否存在G-quadruplex特有的 谱。但是，测定CD谱的装置非常昂贵并且大型。而且，分析时间也需要长达30分钟左右的 时间，并且一次能够分析的试样数量也通常为一种，因此在高通量性的方面很差。另外，使 用CD还存在无法根据四链的形状而从DNA的其它形状中识别的问题。作为解决该问题的方法，如图3所示，可以列举在上述溶液中混合探针材料、检测 该溶液中的信号的方法，该探针材料根据G-quadruplex的有无而发出能够以廉价的装置 分析的信号(吸光度、荧光强度等)。此时，重要的一点为该探针对G-quadruplex的特异 性。即，由于在基因组DNA中存在占大部分的双链DNA结构和以上述的端粒部位的悬端部 分为代表的单链DNA结构，因此，与这些结构比较时对G-quadruplex的特异性是很重要的。 因此，尽管希望单独研究G-quadruplex的有无，但探针对G-quadruplex的特异性低，结果 探针也与单链DNA或双链DNA相互作用而产生信号，则正确检测溶液中的G-quadruplex变 得困难。另外，当使用现有技术研究试样中的Quadruplex预测序列DNA在实际中能否形成 G-quadruplex时，如图4所示。即，首先在溶液中准备具有Quadruplex预测序列的DNA。 之后，将该溶液置于形成G-quadruplex的反应条件下，使G-quadruplex形成反应进行。接 着，可以通过进行CD谱测定对反应后的溶液中是否存在G-quadruplex进行分析。但是，此 时也产生如上所述的装置昂贵、大型的问题以及高通量方面的问题。因此，此时如果也有如 图3所示的G-quadruplex检测用探针则非常有用。具体而言，如图5所示，将该探针混合在上述G-quadruplex形成反应后的溶液中， 测定由此发出的信号即可。此时，G-quadruplex形成反应前的Quadruplex预测序列DNA， 如上所述，由于也存在单链或双链DNA的可能性，因此探针对G-quadruplex的特异性极为 重要。即，如果在上述G-quadruplex形成反应后，Quadruplex预测序列DNA没有全部形 成G-quadruplex时，或只有一部分形成时，上述探针也与Quadruplex预测序列DNA原本 的结构(单链或双链DNA)相互作用从而产生信号，则正确检测所形成的G-quadruplex变 得困难。反之，当探针对G-quadruplex的特异性极高时，在图5所示的方法中，就可以从 G-quadruplex形成反应前事先在溶液中混合探针，也能够防止操作的繁琐性。如上所述，形成G-quadruplex的富G序列发现存在于染色体中与癌化和老化等 相关的部位，因而预测将来能够通过研究患者的染色体中的G-quadruplex而进行疾病诊 断。因此，可以说开发一种能够特异性检测G-quadruplex的方法是非常重要的课题。另外， 作为上述探针的特性，如果其不仅能够特异性检测G-quadruplex和Quadruplex预测序列 DNA,而且能够根据它们的存在量而产生信号增大或者减小的变化，则不仅能够仅仅进行检 测，而且还能够定量进行分析，从而当然会更有用。另外，已知有称为端粒酶的酶。该酶是由RNA和逆转录酶等形成的复合体，能够复 制由于细胞分裂而变短的端粒部位的富G侧的重复序列而延长(S卩，在人类的情况下，端粒 酶添加5' -TTAGGG-3'序列(序列序号1)，以下，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ检测方法，检测试样溶液中的Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ，其中，该试样溶液含有形成单链结构、双链结构和Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ中的至少任一种以上的结构的ＤＮＡ，其特征在于，所述方法依次包括以下工序：（ａ）准备含有阴离子性平面型酞菁的溶液的工序；（ｂ）将含有所述阴离子性平面型酞菁的溶液与所述试样溶液混合的工序；（ｃ）测定所述（ｂ）工序之后的混合液在６４０～７４０ｎｍ的吸光度的工序；和（ｄ）如果在所述６４０～７４０ｎｍ出现最大吸收峰，则判定所述试样溶液中含有形成Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ结构的ＤＮＡ的工序。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2008-5-27 2008-137574一种G-quadruplex检测方法，检测试样溶液中的G-quadruplex，其中，该试样溶液含有形成单链结构、双链结构和G-quadruplex中的至少任一种以上的结构的DNA，其特征在于，所述方法依次包括以下工序(a)准备含有阴离子性平面型酞菁的溶液的工序；(b)将含有所述阴离子性平面型酞菁的溶液与所述试样溶液混合的工序；(c)测定所述(b)工序之后的混合液在640～740nm的吸光度的工序；和(d)如果在所述640～740nm出现最大吸收峰，则判定所述试样溶液中含有形成G-quadruplex结构的DNA的工序。2.如权利要求1所述的G-quadruplex检测方法，其特征在于所述阴离子性平面型酞菁，是具有铜、锌、钴或者镍作为配位金属的阴离子性平面型酞 菁、或者不具有配位金属的阴离子性平面型酞菁。3.如权利要求1所述的G-quadruplex检测方法，其特征在于所述阴离子性平面型酞菁具有选自羧基、羧基的金属盐、磺基以及磺基的金属盐中的 至少一种官能团。4.一种形成G-quadruplex的DNA的检测方法，通过研究试样溶液中含有的形成单 链结构和双链结构中的至少一种以上的结构的DNA是否形成G-quadrup 1 ex，检测形成 G-quadruplex的DNA，其特征在于，所述方法依次包括以下工序(a)将所述试样溶液置于G-quadruplex形成反应条件下的工序；(b)准备含有阴离子性平面型酞菁的溶液的工序；(c)在所述(a)工序之前或之后，将含有所述阴离子性平面型酞菁的溶液与所述试样 溶液混合的工序；(d)测定所述(a) (c)的一系列工序之后的混合液在640 740nm的吸光度的工...
【专利技术属性】
技术研发人员：夜久英信，三好大辅，
申请(专利权)人：松下电器产业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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