有效建立诱导的多能干细胞的方法技术

本发明专利技术提供了改善诱导的多能干（ｉＰＳ）细胞建立效率的方法，其包括在体细胞核重编程步骤中抑制ｐ５３功能。ｐ５３功能的抑制通过使选自下述的物质与体细胞接触等来达到：（１）ｐ５３的化学抑制剂、（２）ｐ５３的显性失活突变体和其编码核酸、（３）针对ｐ５３的ｓｉＲＮＡ和ｓｈＲＮＡ以及其编码ＤＮＡ、和（４）ｐ５３途径抑制剂。本发明专利技术还提供了用于改善ｉＰＳ细胞建立效率的试剂，所述试剂包含ｐ５３功能抑制剂，特别是（１）ｐ５３的化学抑制剂、（２）ｐ５３的显性失活突变体和其编码核酸、（３）针对ｐ５３的ｓｉＲＮＡ和ｓｈＲＮＡ以及其编码ＤＮＡ、和（４）ｐ５３途径抑制剂。本发明专利技术进一步提供了产生ｉＰＳ细胞的方法，其包括使核重编程物质和ｐ５３功能抑制剂与体细胞接触。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及改善诱导的多能干细胞(下文称为iPS)建立效率的方法和为此的药 物。更具体而言，本专利技术涉及通过在体细胞核重编程步骤中抑制P53功能来改善iPS细胞 建立效率的方法，和利用P53功能抑制剂作为活性成分的 用于改善iPS细胞建立效率的试 剂。
技术介绍
近年来，小鼠和人iPS细胞已相继建立。Yamanaka等人通过下列诱导iPS细胞将 0ct3/4、Sox2、Klf4和c_Myc基因引入得自报道小鼠(r印ortermouse)的成纤维细胞内，其 中将新霉素抗性基因敲入Fbxl5基因座内，并且迫使细胞表达该基因(1，2)。Okita等人(3) 通过下列成功地建立了 iPS细胞(Nanog iPS细胞)，所述iPS细胞显示与胚胎干(ES)细胞 中的那些几乎相同的基因表达和后生修饰产生转基因小鼠，其中绿色荧光蛋白(GFP)和 嘌呤霉素抗性基因整合到Nanog的基因座内，它们的表达比Fbxl5表达更集中于多能细胞 中，迫使得自小鼠的成纤维细胞表达上述4种基因，以及选择嘌呤霉素抗性和GFP阳性的细 胞。相似结果也由其他小组确认(4，5)。其后，揭示iPS细胞也可以利用除c-Myc基因之外 的3种因子来产生(6)。此外，Yamanaka等人通过将与小鼠中所使用的那些相同的4种基因引入人皮肤成 纤维细胞内成功建立了 iPS细胞(1，7)。另一方面，Thomson等人的小组使用Nanog和Lin28 代替Klf4和c-Myc产生了人iPS细胞(8，9)。Park等人(10)使用TERT和SV40大T抗原 加上4种因子0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc产生了人iPS细胞，其中所述TERT被认为是人 细胞无限增殖基因。因此，已证实在通过将所限定的因子引入到体细胞内在人和小鼠二者 中所能够产生的多能性方面，iPS细胞与ES细胞相当。然而，iPS细胞建立效率低至小于1%。特别地，当通过引入除c-Myc外的3种因 子(0ct3/4、SoX2和Klf4)而产生它们时，会出现极低效率的iPS细胞建立的问题，其中，担 心c-Myc在组织中会引起肿瘤发生或由iPS细胞分化的个体成为体细胞。提及的参考文献1.W0 2007/069666 Al2. Takahashi，K.禾口 Yamanaka，S. , Cell, 126 663-676 (2006)3. Okita, K.等人，Nature, 448 :313_317 (2007)4. ffernig, M.等人，Nature，448 :318_324 (2007)5. Maherali, N.等人，Cell Stem Cell，1 :55_70 (2007)6. Nakagawa，Μ.等人，Nat. Biotethnol.，26 :101_106 (2008)7. Takahashi，K.等人，Cell，131 :861_872 (2007)8. WO 2008/118820 A29. Yu, J.等人，Science，318 :1917_1920 (2007)10. Park, I. H.等人，Nature, 451 141-146 (2008)专利技术概述本专利技术的目的是提供改善iPS细胞建立效率的手段；本专利技术的另一个目的是提供使用该手段有效产生iPS细胞的方法。本专利技术人以实现上述目的为目标进行了广泛研究，并且发现通过在体细胞核重编 程步骤中抑制P53功能，可以显著增加iPS细胞建立效率。该效应在人细胞中特别显著。此 夕卜，通过抑制P53功能，即使用3种因子，也获得了比常规方法更接近于用4种因子的效率 的建立效率。此外，本专利技术人通过缺失P53功能成功地容易地建立了 iPS细胞，即使对于其 照惯例认为难以建立iPS细胞的T淋巴细胞，并且已开发了本专利技术。因此，本专利技术提供了 [1]改善iPS细胞建立效率的方法，其包括在体细胞核重编程(nuclear reprogramming)步骤中抑制p53功能。[2]根据上述[1]的方法，其中通过使P53的化学抑制剂与体细胞接触而抑制所述 P53功能。[3]根据上述[1]的方法，其中通过使p53的显性失活突变体(dominant negative mutant)或其编码核酸与体细胞接触而抑制所述p53功能。[4]根据上述[1]的方法，其中通过使选自针对p53的SiRNA和shRNA以及其编码 DNA的核酸与体细胞接触而抑制所述p53功能。[5]根据上述[1]的方法，其中通过使P53途径抑制剂与体细胞接触而抑制所述 P53功能。[6]用于改善iPS细胞建立效率的试剂，所述试剂包含p53功能抑制剂。[7]根据上述[6]的试剂，其中所述抑制剂是化学抑制剂。[8]根据上述[6]的试剂，其中所述抑制剂是p53的显性失活突变体或其编码核酸。[9]根据上述[6]的试剂，其中所述抑制剂是选自针对p53的SiRNA和shRNA以及 其编码DNA的核酸。[10]根据上述[6]的试剂，其中所述抑制剂是p53途径抑制剂。[11]产生iPS细胞的方法，其包括使核重编程物质和p53功能抑制剂与体细胞接 触。[12]根据上述[11]的方法，其中所述抑制剂是化学抑制剂。[13]根据上述[11]的方法，其中所述抑制剂是P53的显性失活突变体或其编码核酸。[14]根据上述[11]的方法，其中所述抑制剂是选自针对p53的siRNA和shRNA以 及其编码DNA的核酸。[15]根据上述[11]的方法，其中所述抑制剂是P53途径抑制剂。[16]根据上述[11]的方法，其中所述核重编程物质是0ct3/4、Klf4和Sox2，或其 编码核酸。[17]根据上述[11]的方法，其中所述核重编程物质是0ct3/4、Klf4、Sox2和 c-Myc，或其编码核酸。[18]根据上述[11]的方法，其中所述体细胞是T细胞。[19] iPS细胞，其中T细胞抗原受体(TCR)基因得到重排，通过使T细胞重编程而获得所述iPS细胞。[20] iPS细胞，其包含p53的显性失活突变体或编码针对p53的siRNA或shRNA的 外源核酸。因为p53功能抑制剂使得能够显著增加iPS细胞建立效率，所以这在借助于除 c-Myc外的3种因子诱导iPS细胞中特别有用，对于这3种因子通常其建立效率极低。因为 担心c-Myc在被再活化时引起肿瘤发生，所以使用这3种因子，iPS细胞建立效率的改善在 将iPS细胞应用于再生医学中具有首要效用。因为得自最终分化的T细胞的iPS细胞在其中具有已重排的TCR，所以iPS细胞可 以用作T细胞免疫治疗剂，前提是iPS细胞由识别呈递特定抗原的细胞(例如，癌细胞、受 感染细胞等)，大量扩增，并且允许再分化成细胞毒性T细胞(CTL)的T细胞诱导。附图简述附图说明图1显示p53缺陷对iPS细胞建立的作用的检查结果。图1㈧和图I(B)分 别显示引入4种因子(0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)诱导iPS细胞的结果，和引入3种因 子(0ct3/4、Sox2、Klf4)诱导iPS细胞的结果。在该图中，“p53+/-”显示关于p53_杂 合-缺陷(hetro-deficient)细胞(对照)的结果；“p53_/_”显示关于p53_纯合-缺陷 (homo-deficie本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改善ｉＰＳ细胞建立效率的方法，其包括在体细胞核重编程步骤中抑制ｐ５３功能。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2008-6-27 61/076487;US 2008-9-9 61/095573;US 20一种改善iPS细胞建立效率的方法，其包括在体细胞核重编程步骤中抑制p53功能。2.权利要求1的方法，其中通过使p53的化学抑制剂与体细胞接触而抑制所述p53功能。3.权利要求1的方法，其中通过使p53的显性失活突变体或其编码核酸与体细胞接触 而抑制所述P53功能。4.权利要求1的方法，其中通过使选自针对p53的siRNA和shRNA以及其编码DNA的 核酸与体细胞接触而抑制所述P53功能。5.权利要求1的方法，其中通过使p53途径抑制剂与体细胞接触而抑制所述p53功能。6.一种用于改善iPS细胞建立效率的试剂，所述试剂包含p53功能抑制剂。7.权利要求6的试剂，其中所述抑制剂是化学抑制剂。8.权利要求6的试剂，其中所述抑制剂是p53的显性失活突变体或其编码核酸。9.权利要求6的试剂，其中所述抑制剂是选自针对p53的siRNA和s...

【专利技术属性】
技术研发人员：山中伸弥，高桥和利，沖田圭介，
申请(专利权)人：国立大学法人京都大学，
类型：发明
国别省市：JP[日本]