益生菌在提高机体特异性免疫力及疫(菌)苗发展中的应用制造技术

本发明专利技术涉及益生菌在提高机体特异性免疫力及疫（菌）苗发展中的应用，对经疫（菌）苗皮下注射和口服途径初次免疫或自然感染获得初次免疫的机体，经一定时间后，采用益生菌如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和表达保护性抗原基因的大肠杆菌，分别和以其不同组合，按与初次免疫相同途径进行免疫调节，以提高机体特异性免疫水平和保护力，结果与对照组比较，具有显著性差异（Ｐ＜０．０５），该免疫策略安全可靠，在利用疫（菌）苗或在自然感染群体中预防和控制传染病方面有很大使用价值和广阔应用前景。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及益生菌如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和表达保护性抗原基因的大肠杆菌，特别涉及使用它们来提高经疫(菌)苗初次免疫或自然感染获得初次免疫机体的特异性免疫水平，以及它们在疫(菌)苗发展和免疫策略方面的应用。理想的疫(菌)苗应符合两个条件一是安全性好，二是具有良好的免疫原性。两者通常是一对矛盾，要么安全性较好，免疫原性较差；要么免疫原性较好，毒副作用较强。这种矛盾限制了疫(菌)苗在实践中的应用和发展。目前，疫(菌)苗的免疫接种方案多为先初次接种，经过一定时间后再实行加强免疫。这种免疫策略程度不一地存在着操作复杂、成本增加、使用麻烦尤其儿童难以接受等缺点。双歧杆菌和嗜酸乳杆菌是人和动物肠道内正常菌群的重要的成员，在抗感染、调节机体免疫、抗衰老、抗肿瘤和提供某些营养物质等方面起着非常重要的作用。肠道正常大肠杆菌也是正常菌群成员之一，它作为保护性抗原基因的载体，在疫(菌)苗研究中被广为使用。但是，本专利技术所涉及的利用益生菌如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和表达保护性抗原基因的大肠杆菌来提高机体特异性水平和免疫力的免疫程序和策略，在国内外未有报道。本专利技术之目的，是利用益生菌如分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和表达疫(菌)苗保护性抗原基因的大肠杆菌，对经疫(菌)苗皮下注射和口服途径初次免疫的机体，或自然感染获得初次免疫的机体，经过一定时间后，通过与初次免疫相同的途径，分别和以其不同的组合对初次免疫机体进行免疫调节，来解决经疫(菌)苗初次免疫或自然感染获得初次免疫以后，特异性免疫力下降和保护期短的问题。本专利技术的内容要点与技术方案如下1.选用无特异病原体(Specific pathogen free SPF)动物BALB/c小鼠(购自卫生部北京药品生物制品检定研究所)，雌雄各半，随机分组，雌雄分盒饲养。2.菌种来源于中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所，菌种主要特征(见附表1)。附表1. 菌种的主要特征名称 主要特征福氏2a志贺氏菌301野生型毒株痢疾I型志贺氏菌112 野生型毒株DOM3* 双价(福氏2a、痢疾I型志贺氏菌)菌苗；thyA-；无抗生素抗性E.coli X511表达痢疾I型志贺氏菌脂多糖的大肠杆菌分叉双歧杆菌 从正常儿童粪便中分离嗜酸乳杆菌E.coli LE392 基因工程菌株*志贺氏菌双价菌苗候选株DOM3以福氏2a志贺氏菌thy A基因缺陷株为受体菌，转入痢疾I型志贺氏菌的菌体抗原基因构建而成。3.细菌培养志贺氏菌双价菌苗候选株DOM3和E.coli.X511，分别从-70℃冰箱取出复苏培养，挑取单个菌落，用LB(NaCl 10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，加蒸馏水至1000ml，PH7.4)培养基；野生型毒株福氏2a志贺氏菌301和痢疾I型志贺氏菌112，分别从-70℃冰箱取出复苏培养，挑取单个菌落，用PA(牛肉膏1.5g，NaCl 3.5g，K2HPO4.3H2O 4.8g，KH2PO41.32g，胰蛋白胨5g，葡萄糖1g，酵母粉1.5g，加蒸馏水至1000ml，PH7.2)培养基；于摇床中37℃、160转/分钟过夜培养，次日作50倍稀释，继续培养2-3小时。分叉双歧杆菌从冻干菌种管复苏后厌氧培养，挑取单个菌落，用BL(牛肉膏3g，多蛋白胨10g，胰蛋白胨3g，植胨3g，葡萄糖10g，酵母粉5g，可溶性淀粉0.5g，吐温801ml，5％半胱氨酸10ml，肝汤150ml，羊血50ml，琼脂15g，溶液A10ml，溶液B.5ml，加蒸馏水至1000ml，PH7.2；溶液AKH2PO425g，K2HPO425g，加蒸馏水至250ml；溶液BMgSO4.7H2O 10g，FeSO4.7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，MnSO40.337g，加蒸馏水至250ml)培养基，于厌氧罐中37℃培养48-72小时。嗜酸乳杆菌，从-70℃冰箱取出复苏培养，挑取单个菌落，用MRS(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，K2HPO42.0g，醋酸钠5.0g，枸缘酸三氨2.0g，吐温80 1ml，MgSO4.7H2O 200mg，MnSO4.4H2O 50mg，加蒸馏水至1000ml，PH6.0)培养基在37℃温箱中静置过夜培养。收集菌体，用生理盐水(皮下注射免疫)或0.2mol/LNaHCO3(口服免疫)配制成所需要的菌浓度。4.经皮下注射初次免疫及免疫调节的程序菌苗候选株DOM3皮下注射初次免疫程序(见附表2)；皮下注射免疫调节程序(见附表3)，在最后一次皮下注射初次免疫6周后(即第7周内)，通过皮下注射途径，分别给予分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和E.coli X511和其不同的组合，对经初次免疫的小鼠进行免疫调节。附表2.皮下注射初次免疫程序菌名菌量(CFU)/0.1ml 间隔日部位次数DOM3 1083腹股沟皮下 3附表3.皮下注射免疫调节程序组别菌量CFU/0.1ml 间隔日部位次数分叉双歧杆菌 10103腹股沟皮下 3嗜酸乳杆菌 10103腹股沟皮下 3E.coli X511 1093腹股沟皮下 3分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌各10103腹股沟皮下 3分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌+E.coli.X511各1010+1093腹股沟皮下 3生理盐水 0.1ml 3腹股沟皮下 35.经口服初次免疫和免疫调节及抗体监测程序(见附表4)。其中S，断尾取血50μl，稀释20倍，离心取稀释血清；F，取小鼠粪便，稀释10倍，置4℃浸泡过夜，经12,000rpm×10分钟离心取上清；V，经口灌入志贺氏菌双价菌苗候选株DOM3 109/ml×0.5ml；N，经口灌入0.5ml 0.2mol/L NaHCO3溶液；X，经口灌入E.coli X511菌109/ml×0.5ml；L，经口灌入嗜酸乳杆菌109/ml×0.5ml；B，经口灌入分叉双歧杆菌109/ml×0 5ml；M1，经口灌入分叉双歧杆菌109/ml，嗜酸乳杆菌109/ml等量混合液0.5ml；M2，经口灌入分叉双歧杆菌109/ml，嗜酸乳杆菌109/ml，E.coli X511菌109/ml等量混合液0.5ml。所有菌液均用0.2mol/L NaHCO3配制。附表4.经口服初次免疫和免疫调节及抗体监测程序组别\天 03 714 30 33374460I S，F，V S，F S，F S，F S，F，N S，F S，F S，F S，FII S，F，V S，F S，F S，F S，F，X S，F S，F S，F S，FIIIS，F，V S，F S，F S，F S，F，L S，F S，F S，F S，FIV S，F，V S，F S，F S，F S，F，B S，F S，F S，F S，FV S，F，V S，F S，F S，F S，F，M1 S，F S，F S，F S，FVI S，F，V S，F S，F S，F S，F，M2 S，F S，F S，F S，FVIIS，F，N S，F S，F S，F S，F，N S，F S，F S，F S，FVIII S，F S，F S，F S，F S，F S，F S，F 本文档来自技高网...

【技术保护点】
益生菌在提高机体特异性免疫力及疫（菌）苗发展中的应用，其特征是对机体通过皮下注射和口服途径进行初次免疫，或自然感染获得初次免疫，经过一定时间后，按与初次免疫相同的途径，分别给予益生菌如分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和表达疫（菌）苗保护性抗原基因的大肠杆菌及其不同的组合，对初次免疫的机体进行免疫调节，以提高机体的特异性免疫水平和保护力。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建国，林纪胜，蓝景刚，
申请(专利权)人：中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]