本发明专利技术涉及一种具有免疫原性的细菌多糖－蛋白结合疫苗，具体讲，涉及一种采用重组轮状病毒蛋白与细菌多糖以共价键连接的结合疫苗，本发明专利技术还涉及一种编码本发明专利技术所述重组轮状病毒蛋白的核苷酸序列、重组表达系统、重组表达系统所表达的蛋白，以及这种结合疫苗的制备方法。本发明专利技术还涉及一种肺炎球菌多糖－重组轮状病毒蛋白结合疫苗。其中，细菌多糖以共价键与重组轮状病毒表面蛋白相连接，所述的重组轮状病毒蛋白选自Ｐ基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列、Ｇ基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，具体讲，涉及一种采 用轮状病毒蛋白与细菌多糖共价键连接的结合疫苗。
技术介绍
通过接种疫苗来预防疾病是人类在一个多世纪的临床实践中，证明是行之有效的 手段。经过多年的努力，医学界已经开发出各种不同的疫苗用以预防，诸如细菌、病毒和真 菌等，感染造成的各种疾病，极大地提高了人类的健康水平。生物技术的不断发展，促进了 疫苗品种的多样化。今天，用以预防病毒导致的传染病有灭活病毒技术开发出来的疫苗，如 乙脑疫苗、脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗等；用减毒病毒技术开发出来的减毒活疫苗，如轮状 病毒疫苗、口服脊髓灰质炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗、风疹病毒疫苗和水 痘疫苗等。预防细菌性传染病的有用蛋白和多糖等生物大分子纯化技术开发出来的细菌类 疫苗，如破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳类毒素及其亚细胞组分、流行性脑膜炎球菌多 糖和23价肺炎球菌多糖等。用基因重组蛋白技术开发出来的疫苗，如乙肝表面抗原(预防 乙型肝炎)、人类乳头状类病毒颗粒病毒(预防子宫颈癌)等。用半化学结合技术开发出 来的预防脑膜炎和肺炎的细菌疫苗，如流行性嗜血杆菌b型多糖-蛋白结合疫苗、7价或10 价肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗以及4价脑膜炎球菌多糖-蛋白结合疫苗。由此可见，医 学生物技术的发展，是疫苗产品不断发展的原动力，通过对生物技术的不断改进，能够开发 出更多的新型疫苗产品来应付不同的传染病对人类健康的挑战。细菌感染仍然是儿童的主要杀手，尤其是发展中国家，每年有数百万的儿童因患 传染病而死亡，其中最常见的病原体有肺炎球菌、流行性嗜血杆菌b型、奈瑟氏脑膜炎球 菌、沙门氏伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌和引起腹泻的痢疾杆菌、沙门氏菌和霍乱弧菌等。从化学结构上来看，以上每一个病原体都拥有一个细胞表面荚膜多糖(Capsular polysaccharide, CPS)或脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)壳，或者两者兼有，其功能是 帮助病原体感染宿主。荚膜多糖能够屏蔽细菌细胞表面功能成分免于被宿主免疫系统识 别，防止补体系统被细菌表面蛋白激活和免疫细胞吞噬，如果细菌被吞噬，荚膜多糖能够防 止细菌被杀灭。大多数病原菌中，不同的菌株表达不同结构的荚膜多糖和脂多糖，产生多种 不同的血清型菌株。流行性嗜血杆菌绝大多数是由b型一种血清型引起，肺炎球菌所致的 肺炎和脑膜炎是由已知的90种血清型中的很大一部分菌株感染所导致的，脑膜炎球菌造 成的脑膜炎则主要是A、B和C群细菌感染引起，尽管W135和Y型也开始出现。由此可见， 大多数细菌多糖类疫苗必需含有多种不同种类的细菌多糖以提高致病菌株覆盖率，优化和 选择包含何种细菌或者血清型多糖在疫苗中是一个非常复杂的流行病学问题。一旦明确何 种多糖抗体具有保护作用，则可用这种多糖作为免疫原来生产疫苗。临床使用证明，荚膜多 糖制作的疫苗明确有效，并在多个国家广泛使用。但是这类疫苗有几个缺陷，第一，具有重 复结构的多糖是T细胞独立型2类的免疫原，没有T细胞的参与，它们是无法诱导免疫记忆 效应，刺激机体产生的抗体主要是IgM和IgG2，不能够有效地激活补体系统；第二，更重要的是这种疫苗不能够诱导年龄小于2岁的婴幼儿产生免疫应答来预防疾病，而这一人群正 是免疫系统发育不完善，容易患传染病的高危人群。荚膜多糖和脂多糖的0-特异性多糖具有严格的重复性化学结构，这个化学结构 可由一个单糖单位或含有最多达7-8单糖残基形成的寡聚糖组成。这种重复性单位可为线 性或含有非碳水化合物取代基团的分叉结构，这些非碳水化合物取代基团可为0-乙酰基 (0-acetyl)、甘油磷酸(glycerol phosphate)或丙酮酸(pyruvate)。细菌多糖可能含有不 常见的单糖残基，如二氨基(diamino-)，脱氧和分叉链糖等。总的来说，荚膜多糖倾向于带 负电，而0-特异性寡聚糖为中性。试验表明，相对少量高亲和力的直接针对多糖主链结构 的抗体在免疫学上最为重要。半化学结合技术(也称结合技术)开发疫苗的方法是从20世纪80年代出现的开 发细菌疫苗的技术。John Robbins通过将流行性嗜血杆菌b型(Haemophilusinfluenzae type b，Hib)荚膜多糖(Polyribosylribitolphosphate，PRP)，用共价键的形式连接到蛋 白载体(破伤风类毒素)合成出了流行性嗜血杆菌b型多糖PRP-破伤风类毒素结合疫苗 (PRP-TT)，在免疫动物后，能够产生杀菌的保护性抗体，从而开创了新一代细菌疫苗开 发技术。特别有意义的是，对于年龄小于2岁的婴幼儿来说，由于免疫系统发育不完善，多 糖对于婴幼儿是属于一种非T细胞依赖性抗原，不能够刺激机体如成人一样产生长效的针 对于该多糖来源的细菌特异性保护IgG抗体。因此，多糖对于小于2岁的婴幼儿是一种半 抗原，不能够作为疫苗来接种小于2岁的儿童。当将细菌多糖以共价键的形式连接到蛋白 载体，如破伤风类毒素(Tetanus Toxoid, TT)，由于蛋白质是一种T细胞依赖性抗原，能够 将共价键连接的多糖转变成T细胞依赖性抗原，从而刺激机体产生针对于该多糖的特异性 IgG抗体，保护机体不受细菌的感染。流行性嗜血杆菌b型多糖-破伤风类毒素(PRP-TT)结合疫苗开发的成功，开创 了一个开发细菌疫苗的技术平台，即将细菌多糖，如荚膜多糖，0-特异性多糖(0-specific polysaccharide)，或寡聚糖(Oligosaccharide)，以共价键连接到蛋白载体上而制成的结 合疫苗。基于这一概念的成功，医学生物研究界通过采用同一种化学合成方法开发出了不 同细菌的结合疫苗；同样也用不同的合成技术开发出同一种细菌的结合疫苗。1980年，John Robbins用溴化氰来随机活化Hib荚膜多糖，然后，将己二酰二胼(Adipic Dihydrazide, ADH)作为连接物(linker)加到活化的多糖上，最后以EDC法将衍化后的多糖共价键 地连接到载体蛋白破伤风类毒素上，合成出了流行性嗜血杆菌b型多糖-破伤风类毒素结 合疫苗(PRP-TT)。由于在每个多糖链上有多个活化点，蛋白载体上同样的有多个连接点， 形成的结合物是一种多糖和蛋白交叉连接的大分子，平均分子量约为5X106Da。1980年， Harold Jennings 在美国专利 4356170 里，陈述了用牛血清蛋白(Bovine serum albumin, BSA)为载体，将脑膜炎球菌的A，C群多糖通过还原胺法共价键地连接到BSA上，合成出了 流行性脑膜炎多糖-BAS结合疫苗。1987年和1990年，Porter Anderson分别在美国专利 4673574 和 4902506 里，描述了用变异无毒株白喉毒素 197 (Cross reaction material sub 197，CRM197)作为载体蛋白，以还原胺法合成了流行性嗜血杆菌b型寡聚糖-变异无毒株白 喉毒素197 (HbOC-CRM197)结合疫苗。具体的方法是用高碘酸钠氧化Hib荚膜多糖，产生在两 末端为醛基的寡聚糖，通过还原剂氰基硼氢化钠(sodiumcyanoborohydride本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李建平，
申请(专利权)人：李建平，
类型：发明
国别省市：32
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