新孢子虫疫苗制造技术

本发明专利技术提供了制备自新孢子虫细胞的匀浆物，以及由其制备的抗新孢子虫病的疫苗，所述疫苗可用于预防哺乳动物的临床疾病和流产。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗病原体原生动物新孢子虫的疫苗，所述疫苗可用于预防哺乳动物临床疾病和流产。本专利技术的疫苗含有制备自新孢子虫种之细胞的匀浆物。哺乳动物的新孢子虫病是由原生动物寄生虫新孢子虫(Neospora)的病原体株感染引起的，此病已被认为是流产，未满月婴儿死亡，先天感染和脑炎疾病的主要原因，Dubey和Lindsay,1996,Vet.Parasitol,67:1-59；Dubey和Lindsay,1993,Parasitol.Today,9:452-458。Neospora caninum感染狗并先天性地感染小狗，经常导致瘫痪。已从自然感染的小狗中分离出N.caninum的速殖子，Dubey和Lindsay,1989,J.Parasitol,75:163-165。新孢子虫的感染也是奶牛流产的主要原因。也已报道了山羊，绵羊和马中的新孢子虫病病例。尽管N.caninum表面上与病原体Toxoplasma gondii相似，但N.caninum和T.gondii在抗原性和超微结构上相互之间有所不同，Dubey和Lindsay,1993，文献同上。另外，分离自流产牛胎脑并在体外连续培养的新孢子虫种原生动物寄生虫显示出在抗原性和超微结构上与T.gondii和Hammondia hammondi有所不同，但与N.caninum最为相似，Conrad等，1993,Parasitology,106:239-249。另外，对核小亚单位核糖体RNA基因的分析表明分离自奶牛和狗的新孢子虫株之间没有核苷酸差异，但当与T.gondii相比时，皆显示出一致的差异，因此进一步证实了病原体之间的区别，Marsh等，1995,J.Parasitol,81:530-535。已证实了牛流产和先天性疾病中新孢子虫牛分离物的病原学作用，Barr等，1994,J.Vet.Diag.Invest,6:207-215。使用被N.caninum感染的近交BALB/c小鼠已建立了中枢神经系统新孢子虫病的啮齿类模型，Lindsay等，1995,J.Parasitol,81:313-315。另外，Cole等，1995,J.Parasitol,81:730-732和Long等，1996,J.Parasitol,82:608-611分别描述了研究怀孕的杂交和近交小鼠中N.caninum的跨胎盘传递的模型。另外，已建立了与天然获得的新孢子虫诱导的奶牛流产很类似的实验性N.caninum矮小山羊模型，Lindsay等，1995,Am.J.Vet.Res,56:1176-1180。WO 9525541公开了牛新孢子虫的生物纯培养物，检测抗新孢子虫之抗体和新孢子虫特异性核酸的方法，以及可用作疫苗的含有牛新孢子虫抗原和载体的组合物。以前未公开过可抗新孢子虫病的含有制备自新孢子虫细胞的匀浆物的有效疫苗。第一方面，本专利技术提供了制备自新孢子虫细胞的匀浆物，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病的保护性反应。第二方面，本专利技术提供了保护哺乳动物抗新孢子虫病的疫苗，所述疫苗含有免疫有效量的制备自新孢子虫细胞的匀浆物和兽医学可接受的载体，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病的保护性反应。本专利技术的疫苗还可含有一种或多种其它的免疫调节组分，包括例如佐剂或细胞因子。第三方面，本专利技术提供了制备保护哺乳动物抗新孢子虫病之疫苗的方法，所述方法包括匀浆新孢子虫细胞以产生能在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应的匀浆物，并以适于给哺乳动物施用的方式将免疫有效量的匀浆物与兽医学可接受的载体混合。第四方面，本专利技术提供了保护哺乳动物抗新孢子虫病的方法，所述方法包括给哺乳动物施用疫苗，所述疫苗含有免疫有效量的制备自新孢子虫细胞的匀浆物和兽医学可接受的载体，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应。本专利技术的疫苗可施用于对新孢子虫引起的感染和疾病敏感的任何哺乳动物的种，包括但不限于狗，奶牛，山羊，绵羊和马。第五方面，本专利技术提供了保护哺乳动物以抗新孢子虫病和，任选地抗一种或多种折磨哺乳动物的其它疾病或病理学状态的联合疫苗，所述联合疫苗含有免疫有效量的第一组合物，免疫有效量的第二组合物和兽医学可接受的载体，所述第一组合物含有制备自新孢子虫细胞的匀浆物，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病的保护性反应，所述第二组合物能诱导抗折磨哺乳动物的疾病或病理学状态的保护性反应。联合疫苗中第二组合物的选择基于其诱导抗新孢子虫病或另一种折磨众多哺乳动物种之成员的疾病或病理学状态的保护性反应的能力，这种选择是本领域已知的技术。本专利技术的联合疫苗可另外含有一种或多种其它的免疫调节组分，包括例如佐剂或细胞因子等。第六方面，本专利技术提供了接种哺乳动物以抗新孢子虫病的试剂盒，所述试剂盒含有第一容器和第二容器，其中第一容器中含有免疫有效量的制备自新孢子虫细胞的匀浆物，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应，第二容器中含有兽医学可接受的载体或适于与第一容器中的内容物相混合的稀释剂。第七方面，本专利技术提供了特异于制备自新孢子虫细胞的匀浆物中存在的一种或多种抗原组分的抗体。附图说明图1．BALB/c小鼠之血清的攻击前Western印迹分析。通过SDS-PAGE分级分离NC-1速殖子的完整细胞的匀浆物(“NSA制品”)并转移到PVDF膜上，然后将膜与第一抗血清样品一起温育，接着与碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG温育，并使用生色底物BCIP/NBT显色。泳道1-3=仅施用佐剂(对照)的小鼠的血清；泳道4-6=施用了NSA制品+佐剂(疫苗)的小鼠的血清；示出了分子量标准。经接种小鼠的血清含有可与分子量约为17-19,28-30,33,37,46,48和56KD的NSA制品蛋白质反应的抗体。图2．攻击前(A)和攻击后(B)免疫荧光抗体(IFA)滴度。在含有NC-1速殖子的孔中加入接种后第21天(攻击前第0天)和攻击后第21天的动物血清，然后将孔与(Fab)2异硫氰酸荧光素缀合的抗小鼠IgG+IgM(Kirkegaard & Perry,Gaithersburg,MD)一起温育，洗涤，并通过落射荧光显微术检查。抗体滴度以产生可测荧光之免疫血清的最高稀释度为基础。结果表明与对照相比，在攻击前的接种动物中平均IFA抗体滴度较高(2A)，攻击后IFA抗体滴度显著较高(2B)(P＜0.001)。在2B中，用106攻击，对照几何平均滴度(GMT)=2,691；疫苗GMT=25,600。用107攻击，对照GMT=5,382；疫苗GMT=72,408。图3．攻击前脾抗原特异性增殖测定。在接种后第21天，制备仅施用佐剂(对照)或NSA制品+佐剂(疫苗)之小鼠的脾细胞，并通过在NSA制品存在时温育脾细胞和用胸苷脉冲脾细胞培养物来进行T-细胞增殖测定，如下所述(实施例2)。结果表示为Δcpm(含NSA的平均cpm减去仅有培养基的平均cpm)，结果表明新孢子虫的细胞匀浆物可在体内诱导T-细胞群体，用NSA制品刺激之后，所述群体可在体外增殖。图4．供体攻击前脾抗原特异性细胞因子的产生。在接种后第21天，制备仅施用佐剂(对照)或NSA制品+佐剂(疫苗)之小鼠的脾细胞，通过在NSA制品存在时温育脾细胞，收集无细胞的上清液，并本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备自新孢子虫细胞的匀浆物，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：DA布拉克，M卡泼斯，
申请(专利权)人：辉瑞产品公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]