含透明质酸的角膜保存液制造技术

一种特别在２－８℃下保存角膜组织的溶液，包括平均分子量低于６，０００，０００Ｄａ（较好的是５０，０００－２５０，０００Ｄａ）的透明质酸。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
专利技术目的本专利技术的目的是通过使用含透明质酸的保存液制剂来改进和简化在从供者取出到移植之间的时间里保存用于穿透的角膜移植术中的角膜的保存方法。
技术介绍
穿透的角膜移植术在许多角膜疾病中被广泛地用于修复视力。在严重的角膜营养不良、炎症或退化过程中，穿透的角膜移植术是得到视力复原的唯一有效疗法。在该疗法中的重要问题是从供者取出存活的角膜组织的保存方法。角膜是具有明显界限的无血管组织，外周厚度1毫米，中心厚度0.5毫米。暴露于外部环境部分被成层的、非角朊化的上皮所覆盖，由3-4层扁平的鳞状细胞、1-3层中间上皮细胞和被粘合复合物连接于基底膜和在下面的基质的单层柱样的基础细胞形成了所述的上皮。在角膜保存期间，会失去上皮，但若未损及基底膜，通常在移植后能迅速地再上皮化。基质位于细胞外基层的三个独立层中。从上皮开始，它们包括角膜前弹性层、中间的薄层基质和通常由面对水状液面的内皮细胞系产生的基底层(角膜后弹性层)。基质的其它部分由基质成纤维细胞(通常称为角膜细胞的扁平细胞)所产生和维持。由于盐、胶原质和蛋白多糖(proteoglycans)的存在，基质对于眼泪和水状液都是高渗的。水在上皮面内较少，这可能是由于上皮层的干燥缘故。相似的是，葡萄糖在上皮面里也较少，这是因为该来自水状液的代谢物被上皮大量使用。基质含蛋白多糖(硫酸皮肤素和硫酸角质素)前者在上皮面里的浓度较大，后者在内皮面里的浓度较大。角膜的内皮是单层的、立方形的内皮，从前面小室看去，内皮在角膜后弹性层膜上形成六边形图案。六边形细胞被紧密地连接，但它们没有在细胞周围形成完整的封闭。它们在细胞顶部膜里集中。连接完整性视周围介质中Ca2+的存在而定。该结构使水状液和它的溶质能接近外侧细胞(paracellular)空间。在正常条件下，由于等体积液体被内皮的泵复合物有效地除去，故液体流不会流到肿胀的角膜处，Na+-K+ATP酶是该泵系统的必不可少部分，因此需要由内皮细胞代谢活性产生的ATP。为了完整地评价内皮细胞的功能，人们很有意思地观察到这些细胞在面对水状液侧有免疫球蛋白族成员，ICAM-1(细胞内粘附分子-1)，它作为在白细胞表面上的整联蛋白LFA-1(αL,β2)的共受体。ICAM-1也可作为透明质酸的受体(McCourt,P.A.G.等，(1994)生物化学杂志269,30081-30084)。它指出当内皮细胞到达水状液时，它们与白细胞相互作用。该文献也指出在正常情况下且没有白细胞存在时，与该受体有关的透明质酸能保存内皮层的完整性。角膜的肿胀当内皮的泵功能失去时，基质的高渗导致角膜组织肿胀。肿胀使增加了角膜厚度并降低了角膜的透明度。此外，也会将蛋白多糖从基质中失去而到达周围介质。失去内皮功能的结果是产生病理性的情况(如营养不良、退化、青光眼)。年龄增大会促进内皮代谢失调，因为许多内皮细胞随着年龄增大而减少(从出生到老年约减少50％)。由于内皮细胞的再生能力有限，损伤内皮的完整性只能通过扩大剩余细胞来补偿，这使剩余细胞变薄。损伤内皮也是移植前保存角膜的主要危险因素。这导致角膜肿胀，失去透明度并有进行性的内皮细胞死亡。保存完整的内皮层确实是穿透的角膜移植术前保存角膜的方法的主要目的。角膜的保存来自供者的整个眼球可保存在4℃下的潮湿室内，但必须在24小时里使用。已经成功地发现了保存冷冻状态的角膜(Kaufman,H.E.和Capella J.A.(1968)J.Cryosurg.1,125-129)。在冷冻前，用浓度增加的DMSO和蔗糖处理角膜以防止形成细胞内的冰。困难在于在恒定的低温下处理和运输冷冻的角膜以防止该技术渗滤。另一种方法是，角膜被保存在37℃的器官培养介质中(DoughmanD.J.等(1976)Trans.Am.Acad.Ophtalmol.Otolaringol.81,778-793)。由于培养介质由最理想细胞保存的血清提供，该方法的缺点是通过移植时的角膜使接受者的眼睛暴露于残留量的血清。动物血清会引起免疫反应，而人体血清会传染病毒疾病。目前，角膜保存最常规的方法是在4℃的无血清介质中短期保存。在该温度下，内皮细胞的代谢活性最小。这样，失去了泵功能。通过将保留水的化合物加到保存介质中来防止角膜肿胀。在这些化合物中，最常用的是单独使用的去肿胀化合物、右旋糖酐(McKarey,B.E.和Kaufman,H.E.(1974)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.13,165)或与葡糖胺聚糖(glucosaminoglycan)硫酸软骨素结合使用(Kaufman H.E.等(1991)Arch.Ophthalmol.109,864-868)。但是，硫酸软骨素由于在聚合物中的硫酸盐分子的分布变化而是异种化合物(Scott,1995)。结果，用于角膜保存的组合物各批之间可能有变化。另外，由于硫酸盐分子，硫酸软骨素带有强的负电荷。最近研究提示，强负电荷对于角膜保存是有害的，因为强负电荷降低了角膜内皮的吸附能力(Chen等，1996)。此外，也已报道硫酸软骨素会渗透到角膜里并促进肿胀，特别是在移植前从4℃温热到室温时(Kaufman等，1991)。为了降低由硫酸软骨素引起的角膜肿胀，人们已配制了含如右旋糖酐的去肿胀剂和硫酸软骨素合并使用的角膜保存组合物(EP0517972)。但是，在保存时，右旋糖酐会渗透到基质里，可能在回温时增加肿胀压。另外，现也清楚地知道，右旋糖酐对角膜有毒性，导致产生衰老和退化(Chen等1996)。Ogino等(Mokugan Zen-shi,最近开发的角膜保存介质对角膜内皮的影响-通过电子显微镜扫描的形态学研究，1995)揭示了含透明质酸(HA)保存介质。但Ogimo等使用的透明质酸的分子量为800,000。这样高分子量的透明质酸太粘稠，不宜用来保存介质组份，必须于其它一些保留水的组份结合使用，在不增加溶液粘度情况下防止角膜肿胀，因此，本专利技术的一个目的是提供能给存活的角膜保存提供合适的保存条件，同时避免现有技术中液体缺陷的角膜保存液。专利技术详述本专利技术因此涉及含透明质酸的角膜液组合物，也涉及含适合在低温，特别是2-8℃下保存存活角膜的含透明质酸制剂的应用。本专利技术基于上面已讨论的角膜的构成和功能的下列推论基础上作出(Ⅰ)在低温下保存角膜期间，内皮细胞没有代谢活性。这样，不需要营养和生长因子(血清或其它物质)。不进行泵功能，故不需要支持物。(ⅱ)应当提供足以保持角膜完整性的供有保留水化合物的平衡量的盐溶液。若单个保留水的化合物很合适，则其它诸如右旋糖酐的化合物不再是必需的了。(ⅲ)在内皮细胞上需要保护膜以防止它们在保存时被损伤。与共受体ICAM-1相关的天然配对物是合适的。如上所列，我们已经发现透明质酸是满足在低温下最佳保存角膜要求的合适化合物。透明质酸属于葡糖胺聚糖类，它也包括含硫酸基团的化合物(软骨素、角质素和类肝素)。硫酸盐残留物变化分布的结果是，该组葡糖胺聚糖是不同分子异种化合物。相反的是，透明质酸仅含二糖类单元N-乙酰基葡糖胺和葡糖醛酸。这样，透明质酸是具有确定主要结构的同种化合物含数百个二糖类单元和数百个固定在每个链上的阴离子(羧酸盐基团)的直链。最近，已经发现了透明质酸的次级结构(Scott,J.E.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种角膜保存溶液，包含平均分子量低于６００，０００的透明质酸或其药学上可接受的盐。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：D蓬秦，
申请(专利权)人：菲迪安股份公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]