利用核糖核苷酸还原酶R1抑制恶性肿瘤制造技术

本发明专利技术提供通过使肿瘤细胞与生长调节量哺乳动物核糖核苷酸还原酶Ｒ１的可表达核酸序列相互作用来调节人或者其它哺乳动物中细胞恶性特征的方法。本发明专利技术还提供和应用生长调节量核糖核苷酸还原酶Ｒ１蛋白或生物学活性肽来调节人或其它哺乳动物中细胞恶性特性。可表达核酸序列可以用于基因治疗的载体形式存在。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利
涉及控制肿瘤细胞致瘤性和/或转移的方法。具体地，它涉及核糖核苷酸还原酶R1基因序列及其基因产物抑制恶性肿瘤的用途。相关现有技术描述导致DNA合成的第一个独特步骤是核糖核苷酸转变成它们相应的脱氧核糖核苷酸，这一反应在细胞周期中以特定方式由管家基因核糖核苷酸还原酶催化(Lewis等，1978；Reichard，1993；Wright，1989a；Wright等，1990a；Stubbe，1989)。这种哺乳动物酶包括由位于不同染色体上的两个不同基因编码的、通常称为R1和R2的两个不相似的二聚体蛋白成分[Bjrklund等，1993；Tonin等，1987]。哺乳动物蛋白R1是同型二聚体结构并且具有控制酶活性和底物特异性的底物位点和别构剂位点[Wright，1989b；Thelander等，1980；Caras，1985；Wright等，1990a]。蛋白R2是同型二聚体并形成两个等价的稳定催化作用所需的酪氨酰自由基的二核铁中心[Wright等，1990a；Thelander等，1985；McClarty等，1990]。R1和R2蛋白在它们的C-末端相互作用以形成有活性的全酶[Reichard，1993；Wright等，1990a；Davis等，1994]。除了提供底物用于DNA复制，核糖核苷酸还原酶还有其它生物学功能。例如，它的活性可在S期之外受DNA交联剂如苯丁酸氮芥和UV照射诱导，表明此酶在DNA修复过程的作用[Hurta和Wright，1992]。在细胞周期中，R1和R2有差别地受到调节。R2蛋白从头合成导致R2蛋白S期相关的增加[Lewis等，1978；Mann等，1988]。细胞周期中增殖细胞内核糖核苷酸还原酶活性和由此的DNA合成及细胞增殖通过R2成分的合成和降解得以控制[Eriksson等，1984；Choy等，1988]。此限速R2成分是能够被细胞周期进程的CDC2和CDK2蛋白激酶介质磷酸化的磷蛋白(Chan等，1993)，并且含有稳定酶活性所需的独特酪氨酰自由基的非血红素铁[Reichard，1993；McClarty等，1990]。R1蛋白的水平基本上在增殖细胞的细胞周期期间没有变化并且在整个细胞周期中可检测到。象R2 mRNA，R1 mRNA的合成主要发生在S期[Eriksson等，1984；Choy等，1988；Mann等，1988]。与R2蛋白相比，细胞周期中R1蛋白的更广泛分布是由于其半衰期更长[Choy等，1988；Mann等，1988]。在与肿瘤促进剂或生长因子TGF-β接触的肿瘤细胞中，核糖核苷酸还原酶，尤其是R2成分的调节显著改变[Amara等，1994；Chen等，1993；Amara等，1995b；Hurta和Wright，1995；Hurta等，1991]。在某些人结肠癌中检测到R1缺失[Glenney，1986]。已观察到与非恶性细胞相比，培养的恶性细胞中更高的酶活性水平[Weber，1983；Takeda和Weber，1981；Wright等，1989a]，并且与正常调控组织样品相比，在癌前期和恶性组织中已发现R2蛋白和R2 mRNA水平增高[Saeki等，1995；Jensen等，1994]。在肿瘤促进剂或者生长因子介导的肿瘤进程机制中的转化生长因子β的作用下，转化细胞中核糖核苷酸还原酶，尤其是R2成分的调节明显升高[Amara等，1996；Chen等，1993；Aara等，1995b]。目前，化疗化合物如羟基脲通过使R2蛋白的铁中心去稳定造成酪氨酰自由基的破坏并阻止细胞通过细胞周期S期的进程而抑制核糖核苷酸还原酶的活性[Ashihara和Baserga，1979]。这些药物在治疗人癌症方面应用性有限，因此需要针对核糖核苷酸还原酶的其它方法。分子生物学和人基因组计划中的突破展开了以前意想不到的用哺乳动物基因表达来定向介入的可能性[Blaese，1997；Felgner，1997]。这些方法包括诸如将遗传调控序列和特定蛋白导入肿瘤细胞以杀死增殖细胞的基因治疗方法。利用这种方法修饰其中生长必须受到控制的细胞如肿瘤细胞中核糖核苷酸还原酶的表达将是有用的。专利技术概述根据本专利技术，公开了生长调节量核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列调节人或其它哺乳动物中的细胞致瘤和转移特性的用途。本专利技术还提供调节人或其它哺乳动物中细胞致瘤和转移特性的方法。此方法包括用生长调节量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列作用于肿瘤细胞的步骤，在用于人的实施方案中可以是SEQ ID No1或其特定的R1编码序列。可表达核酸序列可以通过基因运送载体得以运送，基因运送载体可以是用于基因治疗的载体形式。在另一实施方案中，能以药物组合物形式存在的R1基因产物蛋白或其生物学活性肽可以被运送到需要调控的细胞。本专利技术的方法和应用及组合物提供受到调控的细胞中哺乳动物核糖核苷酸还原酶的R1成分普遍升高的表达。附图描述正如通过参考下面的详细描述变得更好理解一样，当与随后的附图一起考虑时，本专利技术的其它优点将容易得到理解，其中附图说明图1A-B是表示对Myc-附加表位的R1表达的分析的照片[Fan等，1996b]，(A)是通过间接免疫荧光测定、来自pSHD/mR1瞬时转染的BHK细胞，而(B)是通过放射免疫沉淀测定、来自稳定的逆转录包装细胞系PA/mR1。抗Myc表位的抗体9E10用于两种测定。图2是表示表达重组R1的细胞在软琼脂中降低的生长效率的条形图。将已稳定地用R1病毒载体侵染的细胞系与适当空载体侵染的对照细胞系比较(表1)。所表示的资料来自至少三个独立的实验，每个实验由每个细胞系的三个重复培养板组成。接种物大小(细胞数/培养板)如下C1/SHD和C1/mR1细胞为5×105，C1/mR2和C1/mR2/mR1细胞为1×105，C1/mR2a/SHD和C1/mR2a/mR1、ras-3/SHD和ras-3/mR1细胞为1×104，并且Colo/SHD和Colo/mR1细胞为1×103。在所有情况下，表达重组R1的细胞与对照细胞之间形成的集落数量的差异是统计学上显著的(P＜0.001)。图3是表示与对照N/ras细胞(A)相比，N/ras & ASR1细胞(B)在软琼脂中增高的集落形成效率的培养皿的照片。每个培养皿接种1×104个细胞。N/ras & ASR1细胞形成至少4倍更多的集落，集落普遍大于由N/ras细胞形成的那些。(A)中所示的集落在培养3周后形成而(B)中所示的集落在培养2周后形成。当分析来自每个细胞系各由4个培养皿组成的6个实验时，发现两细胞系表现的集落形成效率的差异有高度显著性(P＜0.0001)。图4的照片表示(A)表示与对照N/ras细胞(a)相比，N/ras & ASR1(b)中下降的R1蛋白的Western印迹分析结果，并且(B)是(A)中所示的硝酸纤维素膜的印度墨水染色结果[Wright和Anazodo，1996]，表明细胞提取物大约相等的加样量。专利技术详述本专利技术提供通过使用药理学或基因治疗手段在细胞中增加核糖核苷酸还原酶R1的表达来调节人或其它哺乳动物中细胞恶性特征包括肿瘤抑制的方法。例如，可用生长调节量本文档来自技高网...

【技术保护点】
有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶Ｒ１的可表达核酸序列的用途，用于调节哺乳动物中肿瘤细胞的致瘤性。

【技术特征摘要】
US 1997-3-19 60/040,837;US 1997-10-2 60/060,6691.有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列的用途，用于调节哺乳动物中肿瘤细胞的致瘤性。2.含有有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列和药学生理学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物的用途，用于调节哺乳动物中肿瘤细胞的致瘤性。3.有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列的用途，用于抑制哺乳动物中肿瘤细胞的生长。4.含有有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列和药学生理学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物的用途，用于抑制哺乳动物中肿瘤细胞的生长。5.有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列的用途，用于在哺乳动物中进行基因治疗。6.含有有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列和药学生理学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物的用途，用于在哺乳动物中进行基因治疗。7.根据权利要求1-6中的任意一项所述的用途，其中核酸序列以载体形式存在。8.根据权利要求1-6中的任意一项所述的用途，其中核酸序列是SEQID No1。9.根据权利要求1-7中的任意一项所述的用途，其中核酸序列是来自SEQ ID No1的核糖核苷酸还原酶R1蛋白的编码区。10.根据权利要求9所述的用途，其中编码区得到修饰以编码核糖核苷酸还原酶R1的生物学活性肽。11.根据权利要求9所述的用途，其中编码区得到修饰以编码核糖核苷酸还原酶R1的生理学活性类似物。12.有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的用途，用于调节哺乳动物中肿瘤细胞的致瘤性。13.含有有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1和药学生理学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物的用途，用于调节哺乳动物中肿瘤细胞的致瘤性。14.有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的用途，用于抑制哺乳动物中肿瘤细胞的生长。15.含有有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1和药学生理学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物的用途，用于抑制哺乳动物中肿瘤细胞的生长。16.根据权利要求12-15中的任意一项所述的用途，其中核糖核苷酸还原酶R1是生物学活性类似物或衍生物。17.根据权利要求12-16中的任...

【专利技术属性】
技术研发人员：JA莱特，AH扬，
申请(专利权)人：吉倪塞思技术公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]