干扰素-β-1a的聚合物缀合物及其使用制造技术

包含与含有聚亚烷基二醇部分的聚合物偶联的干扰素－β－１ａ的干扰素β多肽，其中干扰素－β－１ａ和聚亚烷基二醇部分的排列使得干扰素－β－１ａ的活性相对于干扰素β的另一种治疗性形式（干扰素－β－１ｂ）有所增强，而且展示的活性与非缀合干扰素－β－１ａ相比没有降低。本发明专利技术的缀合物在治疗性以及非治疗性（如诊断性）应用中可以有效采用。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
干扰素－β－1α的聚合物缀合物及其使用的制作方法
技术介绍
多肽和蛋白质在特殊疾病的全身性治疗中的使用现在已经被医学实践所接受。这些物质在治疗中的作用非常重要，以至于许多研究活动正致力于通过重组DNA技术大量合成。这些多肽中的许多种是非常有潜力且可特异诱发其生物学作用的内源性分子。限制这些蛋白质性质的物质用于期望应用的主要因素是，当非胃肠给药时，它们在短时间内由体内消除。这可能是蛋白酶代谢的结果，或者是通过蛋白质消除常规途径(诸如肾的过滤)而被清除。由于胃中的蛋白水解作用和强酸性，在这些物质到达靶组织前就把它们破坏了，所以施用它们的口服路线甚至更有问题。制药业对于这些蛋白质施用路线的相关问题是熟知的，而且正在尝试各种策略解决它们。已经发表了与蛋白质稳定化有关的大量工作。已知将蛋白质与聚合物物质缀合的多种方法，包括使用葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖肽、聚乙二醇和聚氨基酸。据报道，产生的缀合多肽保留了它们的生物学活性和在非胃肠应用用水中的可溶性。干扰素是许多临床工作和以改进其施用和生物同化为目的的努力所关注的肽家族。干扰素已经在多种临床疾病状态中进行了测试。人干扰素β(该家族成员之一)的使用在多发性硬化症中得到了最好的确认。最近，在欧洲和美国，重组干扰素β的两种形式获得了用于此疾病治疗的许可。一种形式是干扰素-β-1a(商标AVONEX,mfg.Biogen公司，Cambridge,MA)，此后可互换使用“干扰素-β-1a”或“[FN-β-1a”。另一种形式是干扰素-β-1b(商标BETASERON,Berlex,Richmond,CA)，此后使用“干扰素-β-1b”表示。干扰素-β-1a是使用天然人类基因序列在哺乳动物细胞中生产的，并进行了糖基化；而干扰素-β-1b是使用经修饰人类基因序列(在第17位氨基酸位置经基因工程改造用丝氨酸取代半胱氨酸)在大肠杆菌中生产的，而且未进行糖基化。以前，我们中的一些人直接比较了干扰素-β-1a和干扰素-β-1b在功能性实验中的相对体外潜力，结果显示，干扰素-β-1a的比活性比干扰素-β-1b的比活性高大约10倍(Runkel等人，药物研究(Pharm.Res.)15:641-649,1998)。根据设计用来鉴定这些活性差异的结构基础的研究，我们确认了，糖基化是产物间影响比活性的唯一的已知结构差异。碳水化合物的影响很大程度上是通过其对结构的稳定化作用而显现的。碳水化合物的稳定化作用在热变性实验和SEC分析中是明显的。糖基化的缺乏还与聚集的增加和热变性敏感性的增加有关。用PNG酶F由干扰素-β-1a通过酶方法除去碳水化合物，将引起去糖基化产物的广泛沉淀。这些研究表明，尽管干扰素-β-1a和干扰素-β-1b之间存在序列保守性，但是它们是不同的生化实体，由此关于干扰素-β-1b已知的许多知识不能应用于干扰素-β-1a，反之亦然。专利技术概述我们利用了糖基化干扰素β相对于非糖基化形式的优势。具体而言，我们发展了干扰素-β-1a组合物，该组合物相对于干扰素-β-1b具有增高的活性、并具有PEG化蛋白质普遍具有的医疗特性，而且相比于干扰素-β-1a非缀合形式其活性没有有效损失。因此，如果进行修饰后的产物(聚合物-干扰素-β-1a缀合物)保留了所有或大部分生物学活性，则可能产生下列特性导致半衰期增加和组织分布变化的药物动力学和药效动力学变化(如在血管中维持更长时间的能力)、溶液中的稳定性增加、免疫原性降低、保护免受蛋白水解消化和随后的活性消除。这种制剂是制药和医学领域的实质性进步，并将对干扰素具有一些效用的各种疾病(诸如多发性硬化症、纤维变性、和其它炎症性或自身免疫疾病、癌症、肝炎和其它病毒性疾病)的治疗作出显著贡献。具体而言，在血管中维持更长时间的能力使得干扰素-β-1a能够用于抑制血管生成并潜在通过血脑屏障。此外，当配制干扰素-β-1a粉剂形式用于随后的吸入施用时，通过产生聚合物-干扰素-β-1a缀合物得到的热稳定性是有利的。我们根据干扰素-β-1a的结晶学结构的知识，发展了干扰素-β-1a-聚合物缀合物，其中聚合物在干扰素-β-1a上的连接位点使得缀合物保留了相对于非缀合干扰素-β-1a的全部干扰素-β-1a活性。本专利技术的一个方面是缀合的干扰素-β-1a复合物，其中干扰素-β-1a与将聚亚烷基二醇作为完整部分掺入的聚合物共价键合。在一个特定方面，本专利技术涉及包含与聚合物(其包含聚亚烷基二醇部分)偶联的生理学有活性的干扰素-β-1a的生理学有活性的干扰素-β-1a组合物，其中干扰素-β-1a和聚亚烷基二醇部分的排列使得组合物中的生理学有活性的干扰素-β-1a相对于单独的干扰素-β-1a(即没有偶联聚合物的非缀合形式)具有增强的半衰期。本专利技术的另一方面是包含与聚合物偶联的生理学有活性的干扰素-β-1a的干扰素-β-1a组合物，其中干扰素-β-1a是融合蛋白，优选免疫球蛋白融合体。在这种复合物中，N末端(与聚合物的缀合位点)和C末端(与Ig部分的融合位点)非常接近，说明聚合物缀合有可能降低融合蛋白的免疫原性。在另一方面，本专利技术涉及包含与聚合物(其包含聚亚烷基二醇部分)偶联的生理学有活性的干扰素-β-1a的生理学有活性的干扰素-β-1a组合物，其中干扰素-β-1a和聚亚烷基二醇部分的排列使得组合物中的生理学有活性的干扰素-β-1a的活性相对于单独的干扰素-β-1b(即没有偶联聚合物的非缀合形式)增强。本专利技术的另一个实施方案是缀合的干扰素-β-1a蛋白，其中干扰素-β-1a部分进行了突变，从而为突变蛋白提供了相对于干扰素-β-1a非突变形式选择性地有所增强的抗病毒和/或抗增殖活性。本专利技术的另一个方面涉及包含与生理学相容的聚乙二醇部分共价偶联的生理学有活性的干扰素-β-1a的稳定的、水溶性的缀合干扰素-β-1a复合物。在这种复合物中，干扰素-β-1a可以与生理学相容的聚乙二醇部分通过不稳定共价键在干扰素-β-1a的游离氨基酸基团处共价偶联，其中不稳定的共价键在体内被生化水解作用和/或蛋白水解作用切断。在另一个方面，本专利技术涉及包含制药学可接受载体和含有与生理学相容的聚乙二醇偶联的干扰素β的稳定的水溶性干扰素-β-1a复合物的剂型。在其它方面，诸如上述的共价偶联干扰素-β-1a组合物可以采用用于诊断或体外应用的干扰素-β-1a，其中干扰素-β-1a是例如用于免疫实验或其它诊断性或非体内应用的诊断性试剂。在这种非治疗性应用中，本专利技术复合物作为稳定的组合物被高度有效采用，其例如可以在相容溶剂或其它基于溶剂的制剂中进行配制，从而提供抗降解能力增强的稳定组合物形式。用无毒聚合物修饰干扰素-β-1a可以提供某些优势。如果进行修饰后的产物(聚合物-干扰素-β-1a缀合物)保留了所有或大部分生物学活性，则可能产生下列特性导致半衰期增加和组织分布变化的药物动力学和药效动力学变化(如在血管中维持更长时间的能力)、溶液中的稳定性增加、免疫原性降低、保护经修饰干扰素-β-1a免受蛋白水解消化和随后的活性消除；热稳定性增加，导致用于口服或吸入使用的粉状干扰素-β-1a制剂更有效。赋予了上述改进特性的干扰素-β-1a可以在口服、气雾剂、或非胃肠施用后有效地发挥治疗作用。其它施用途径，诸如鼻腔和经皮给药，也可能使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含与非天然聚合物偶联的糖基化干扰素β的组合物，该聚合物包含聚亚烷基二醇部分。

【技术特征摘要】
US 1998-10-16 60/104,572;US 1999-2-16 60/120,1611．包含与非天然聚合物偶联的糖基化干扰素β的组合物，该聚合物包含聚亚烷基二醇部分。2．权利要求1的组合物，其中聚亚烷基部分通过选自下述的基团与干扰素β偶联醛基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、卤代醋酸酯基、多个组氨酸残基、肼基和氨基巯基。3．权利要求1的组合物，其中糖基化干扰素β是干扰素-β-1a，而且在抗病毒实验中测量时比干扰素-β-1b更有活性。4．权利要求3的组合物，其中干扰素-β-1a由抗病毒实验测得保留了缺乏所述聚合物的干扰素-β-1a的效力的0.5至1倍。5．权利要求1的组合物，其中干扰素β是干扰素-β-1a融合蛋白。6．权利要求5的组合物，其中干扰素-β-1a融合蛋白包含免疫球蛋白分子一部分。7．权利要求1或5的组合物，其中干扰素β是具有至少下列一项特性的突变型干扰素β:(a)突变型具有比野生型干扰素-β-1a更高的抗病毒活性，其中抗病毒活性是通过病毒诱导的细胞溶解进行测量的；(b)相对于野生型干扰素-β-1a，突变型的抗病毒活性高于抗增殖活性；(c)突变型可结合干扰素受体，但是与野生型干扰素-β-1a相比，其抗病毒活性和抗增殖活性相对低于其受体结合活性。8．包含与含有聚亚烷基二醇部分的聚合物偶联的生理学有活性的干扰素-β-1a的生理学有活性的干扰素β组合物，其中生理学有活性的干扰素-β-1a和聚亚烷基二醇部分的排列使得，生理学有活性的干扰素β组合物中的生理学有活性的干扰素-β-1a在抗病毒实验中测量时，相对于生理学有活性的干扰素-β-1b具有增强的活性。9．权利要求8的组合物，其中干扰素-β-1a与聚合物在干扰素-β-1a上的N末端位点偶联。10．权利要求8的组合物，其中干扰素-β-1a与聚合物在干扰素-β-1a上的C末端或附近位点偶联。11．权利要求8的组合物，其中干扰素-β-1a与聚合物在某个位点通过干扰素-β-1a上的聚糖部分偶联。12．权利要求8的组合物，其中干扰素-β-1a是干扰素-β-1a融合蛋白。13．权利要求12的组合物，其中干扰素-β-1a融合蛋白包含免疫球蛋白分子一部分。14．权利要求8或12的组合物，其中干扰素-β-1a是具有至少一项下列特性的突变型干扰素-β-1a:(a)突变型具有比野生型干扰素-β-1a更高的抗病毒活性，其中抗病毒活性是通过病毒诱导的细胞溶解进行测量的；(b)相对于野生型干扰素-β-1a，突变型的抗病毒活性高于抗增殖活性；(c)突变型可结合干扰素受体，但是与野生型干扰素-β-1a相比，其抗病毒活性和抗增殖活性相对低于其受体结合活性。15．包含与含有聚亚烷基二醇部分的聚合物以N末端偶联的生理学有活性的糖基化干扰素β的生理学有活性的干扰素β组合物，其中生理学有活性的干扰素β和聚亚烷基二醇部分的排列使得，生理学有活性的干扰素β组合物中的生理学有活性的干扰素β在抗病毒实验中测量时相对于缺乏所述部分的生理学有活性的干扰素β具有基本上相似的活性。16．权利要求15的组合物，其中干扰素β与聚合物在干扰素β上的N末端位点偶联。17．权利要求15的组合物，其中干扰素β与聚合物在干扰素β上的C末端或附近位点偶联。18．权利要求15的组合物，其中干扰素β与聚合物在某个位点通过干扰素β上的聚糖部分偶联。19．权利要求15的组合物，其中干扰素β是干扰素β融合蛋白。20．权利要求19的组合物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：B佩宾斯基，L兰科尔，M布里科尔麦尔，A维蒂，P霍奇曼，
申请(专利权)人：拜奥根IDEC马萨诸塞公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]