本发明专利技术提供具有特殊序列的新肽和其作为信号肽或膜锚定肽的应用。本发明专利技术也涉及嵌合多肽，其包含一或多个这种肽和感兴趣的多肽，还涉及编码这种肽和嵌合多肽的核酸分子，载体，感染性病毒颗粒和宿主细胞。本发明专利技术也涉及药物组合物，其包含这种元件和药物可接受的载体。本发明专利技术也提供一种使用这种肽重组产生多肽的方法，特别是指导胞外或锚定在质膜表面的感兴趣多肽的表达的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】信号传导肽 本专利技术涉及用作信号肽和膜锚定肽的新肽。这些肽来源于多种狂犬病毒株的糖蛋白。本专利技术也提供编码这种肽的核酸分子和载体以及使用这种核酸分子和载体表达指定从 宿主细胞分泌或锚定到细胞膜上的感兴趣多肽的方法。本专利技术也特别相关于在各种原核和 真核体外系统或在动物或人生物体中用于治疗和预防目的的蛋白质表达领域。 在过去二十年中，在生物技术产业内重组多肽的制备已经成为主要的挑战之一。 几个质粒DNA和病毒载体已被制备和用于在培养的宿主细胞或活生物体内表达核苷酸序列，用于多种目的，包括接种疫苗，基因治疗，免疫疗法和在培养的细胞内制备重组多肽。 重组转化的宿主细胞分泌多肽通常是具有优势的，因为从培养上清液比从破坏细 胞释放细胞内蛋白质时产生的复杂的蛋白质混合物中回收重组多肽的纯化步骤容易。而 且，分泌也减少胞内表达对宿主细胞或生物体可能具有的有害(例如毒性)作用。最终，通 过分泌途径的易位也需要进行翻译后修饰和蛋白酶裂解，其在特定多肽的稳定性，折叠，免 疫识别和生物学活性方面具有作用。 通常，分泌的多肽表达为前体，其包括在N末端的信号肽。信号肽通常由3个明显 区域组成N末端和阳性电荷区，中央疏水核心区和由信号肽酶识别的C末端裂解位点。信 号肽确保多肽前体有效的易位穿过内质网(ER)膜。在提供成熟多肽(没有信号肽的多肽) 的易位过程中信号肽被信号肽酶切掉。 一旦多肽进入ER，它被转运到高尔基体，和之后的 分泌途径的大量路线之一，其依赖于多肽的性质和信号传导肽(signaling p印tide)的存 在。例如，多肽可分泌到外部培养基中，或运送到细胞区域如内体和溶酶体区域或锚定到细 胞膜上。本领域已知大量翻译后修饰发生在ER和高尔基体，如多肽的糖基化，二硫键形成 和蛋白酶解。不正确的翻译后修饰典型地导致在生产异质多肽产品中无活性多肽和无效的 信号肽酶裂解，其不能使用，特别是用于人类使用。 另一方面，先前已显示通过以锚定在不同亚细胞区域的细胞膜上或细胞表面 的形式呈递可增强免疫原性多肽的免疫原性活性(Andrew et al， 1990， J. Virol. 64， 4776-4783)，很可能通过改良的I类腿C I和/或II类腿C介导的到宿主免疫系统的呈 递而进行。例如，Ji等 (1999， Human Gene Ther. 10 :2727-2740)报道靶定人乳头瘤病毒 (HPV)-16到内体/溶酶体室增强它的抗肿瘤活性和允许在表达宿主生物体中增加肿瘤细 胞特异性CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒T淋巴细胞的产生。W099/03885揭示质膜上靶 定HPV-16 E6和E7多肽允许改善它们的免疫原性潜力和因此它们在宿主生物体中的疗效。 在细胞表面的膜结合蛋白质的转运和锚定涉及信号肽和膜锚定肽。 虽然，本领域中可获得大量这样的信号传导肽，那些从狂犬病糖蛋白获得的蛋白 质证明特别是在痘病毒介导的表达中是有效的。因此，提供额外的信号传导序列是有用的， 以确保通过细胞分泌途径和/或信号肽酶裂解和/或转运和锚定到大量宿主细胞和生物体 的细胞膜的有效易位。 另外，编码狂犬病糖蛋白衍生的本专利技术目的信号传导肽的核酸序列已被工程化以 减少相互之间的同源性百分比小于75%，因此允许它们用于多基因表达载体，其表达的多 肽从宿主细胞分泌或锚定到细胞膜上例如质膜以便于呈递在细胞表面。但是，非常有限数量的有效的信号传导肽、显著的信号和膜锚定肽限制了从一个单载体表达的核酸序列 的数量。当然，本领域已知，使用相同信号传导肽指导转运和膜锚定由多基因表达载体编 码的多肽的每一个可能导致这些同源序列之间的重组事件和包含于它们之中的核苷酸的 丢失(Matzke， M. ， Matzke， A. J. M. ， Scheid， 0. M. In HomologousRecombination and Gene Silencing in Plants ;Paszkowski， J.Ed. KluwerAcademic Publishers, Netherlands, 1994 ;pp 271-300)。这个不稳定性问题可导致载体原液不可用，特别是对于人的临床实验。 如上所述，在本领域中需要为重组生产分泌的或膜锚定的多肽提供可选择的信号 传导肽，特别是在真核宿主细胞和生物体中。本专利技术为此需要提供了获得自不同狂犬病病 毒株糖蛋白质的新的肽作为信号肽和膜锚定肽。这种肽已证明在指导在真核细胞中表达自 痘病毒载体的感兴趣多肽的分泌和膜锚定是高效的。此外，本专利技术也提供编码这种肽的核 酸分子，其序列已被工程化以使其相互之间呈现小于75%的同源性百分比。使用这种工程 化的核酸分子提供表达自单一载体的多个感兴趣多肽的分泌和膜锚定(当同源序列存在 于这样的载体构建体中时)显著减少自然发生的同源重组事件的可能性。因此，本专利技术在 重组
建立了一个重要工具，特别是在多基因表达载体用于分泌和膜呈递多种多肽 中，特别是在真核宿主细胞中。 通过权利要求书中定义的实施方案解决了这个技术问题。 本专利技术其他和进一步的方面，特征和优点将通过以下本专利技术的优选实施方案的描 述而变得明显。这些实施方案仅是揭示目的。 因此，在第一个方面，本专利技术提供了一个肽，其选自基本上由或由SEQID N0:1、SEQ ID NO :2、 SEQ ID NO :3、 SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列组成的肽组成的 组中。 如本文全文所用，除非另外指出，术语"一个"用于表示"至少一个"、"至少第一 个"、"一或多个"或"多个"参考的化合物或步骤。 如本文所用，术语"和/或"包括"和"、"或"和"所述术语连接的元件的所有或任 何其他组合"的意思。 如本文所用，术语"大约"或"近似"表示给出值或范围的20%以内，优选10%以 内，和更优选5%以内。 如本文所用，当用于定义产品、组合物和方法时，术语"包含"应表示所述产品、组 合物和方法包括提及的成分或步骤，但不排除其他的。"基本上由……组成"是指排除任何 实质意义的其他成分或步骤。因此，基本上由所述成分组成的组合物将不排除微量污染物 和药物可接受的载体。"由……组成"表示排除痕量元素以上的其他成分或步骤。例如，肽 "由氨基酸序列组成"是所述肽除了所述氨基酸序列之外不包任意氨基酸。肽"主要由氨基 酸序列组成"是这个氨基酸序列与仅仅少数额外氨基酸残基(典型从大约1到大约10个左 右的额外残基)共存。肽"包含"氨基酸序列是所述氨基酸序列是所述肽的最终氨基酸序 列的至少一部分。这样的肽可具有多达几百个额外氨基酸残基。这样的额外氨基酸残基在 肽运输，促进多肽生成或纯化；延长半衰期等方面发挥作用。这同样可用于核苷酸序列。 在此使用的术语"氨基酸"指天然L-氨基酸，即20个遗传编码的氨基酸丙氨酸 (Ala或A)，缬氨酸(Val或V)，亮氨酸(Leu或L)，异亮氨酸(Ile或I)，脯氨酸(Pro或P)， 甲硫氨酸(Met或M)，苯丙氨酸(Phe或F)，色氨酸(Trp或W)，甘氨酸(GIy或G)，丝氨酸5(Ser或S)，苏氨酸(Thr或T)，半胱氨酸(Cys或C)，酪氨酸(Tyr或Y)，天冬酰胺(Asn或 N)，谷氨酰胺(Gin本文档来自技高网...
【技术保护点】
选自如下一组中的肽，所述肽基本上由或由ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５所示的氨基酸序列组成。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：N西尔韦斯特雷，E雅各布斯，
申请(专利权)人：特兰斯吉恩股份有限公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]
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