应用生物传感器检测与固定化靶标分子直接结合的小分子的方法技术

本发明专利技术提供应用生物传感器检测与固定化靶标直接结合的小分子的方法。本发明专利技术提供检测小分子与靶分子相互作用的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】应用生物传感器检测与固定化靶标分子直接结合的小分子的方法 优先权 本申请要求2007年4月19日申请的美国专利申请号60/912， 725的权益，该申请通过引用全部结合到本文中。
技术介绍
鉴定针对药物性蛋白质靶的高品质的先导化合物是一项复杂的任务。产生新的可 优化的先导化合物是十分困难的。最近，人们探索出基于碎片的筛选法(fragment-based screening)作为产生高品质先导化合物的方法。分子量约为lOODa至约300Da的化合物 (即"碎片")似乎比分子量约为300Da至约600Da的化合物可提供更好的先导化合物，这种 观点一直用来制备先导化合物。虽然碎片常常是弱结合分子，但是筛选与治疗靶蛋白结合 的低分子量弱结合分子可用于确定小的构建模块，它们可用来通过化学结合提供略高分子 量的紧密结合的化合物。这些分子可具有针对靶蛋白的治疗作用。尽管低分子量化合物可 引导开发出有效的药物，鉴定弱结合但是极低分子量化合物的进展极缓并困难重重。寻找 与蛋白质或靶分子结合的各种大小的化合物的现有方法均涉及需要化合物以一定能量进 行结合，这种能量通常不能通过碎片化合物获得。用于鉴定与蛋白质结合的碎片化合物的 现有鉴定方法需要大量蛋白质，耗费劳力，还需要非常熟练的人员来操作的昂贵仪器，而且 筛选很少几种化合物要花上许多天或者许多周的时间。典型的方法应用经典生物物理学技 术，例如多维核磁共振波谱法(NMR) 、x-射线晶体学检测法或等温滴定量热法(isothermal titrationcalorimetry)。本领域需要使用少量试验化合物以高通量方式筛选基于碎片的 约lOODa至约300Da的化合物文库的方法。 专利技术概述 在一个实施方案中，本专利技术提供测定小分子对靶分子的亲和力的方法。该方法 包括使靶分子固定在比色共振反射生物传感器(colorimetric resonant reflectance biosensor)表面上并测定第一峰波长值；将小分子按3种以上不同浓度加到比色共振反射 生物传感器表面并测定3种以上不同浓度的峰波长值，对峰值波长进行比较以确定小分子 对于靶分子的亲和力。小分子可大约为300Da以下。可以测定小分子的解离常数(Kd)。小 分子的解离常数可约为2， 000 ii M至约750 ii M。小分子的浓度可约为0. 5mM至约0. OlmM。 在另一个实施方案中，本专利技术提供测定小分子样品的等级亲和力(rank affinity)的方法，该方法包括检测比色共振反射生物传感器表面的第一峰波长值；使已 知分子量的靶分子固定在比色共振反射生物传感器表面上并测定第二峰波长值；使用第一 峰波长值和第二峰波长值确定与比色共振反射生物传感器结合的靶分子的摩尔量；将特定 浓度的已知分子量的小分子样品加到比色共振反射生物传感器上并测定第三峰波长值；第 二峰波长值和第三峰波长值之间的差值给出了与比色共振反射生物传感器表面结合的小 分子的量；使用第一峰波长值和第二峰波长值之间的差值与第二峰波长值和第三峰波长值 之间的差值的比率，确定小分子样品的等级亲和力。小分子样品可包含大约300Da以下的 小分子。小分子样品中小分子的解离常数可约为2， 000 M至约750 M。小分子样品中小分子的浓度可约为0. 5mM至约0. OlmM。 本专利技术的又一个实施方案提供测定小分子是否与靶分子的特定位点结合或者与 已知的靶位点封阻剂竟争性结合靶分子的靶位点的方法，该方法包括使靶分子固定在第一 比色共振反射生物传感器上；使靶分子固定在第二比色共振反射生物传感器上，其中靶分 子的靶位点用已知的靶位点封阻剂封闭；将小分子加到第一比色共振反射生物传感器和 第二比色共振反射生物传感器上并测定第一比色共振反射生物传感器和第二比色共振反 射生物传感器的峰波长值，如果第一比色共振反射生物传感器的峰波长值与第二比色共振 反射生物传感器的峰波长值相比发生位移，则小分子与已知封阻剂竟争性结合靶分子的靶 位点或与靶分子的特定位点结合。小分子可约为300Da以下。小分子的解离常数可约为 2， 000 ii M至约750 ii M。小分子的浓度可约为0. 5mM至约0. OlmM。 本专利技术再一个实施方案提供测定300Da以下的小分子是否与靶分子结合的方法， 该方法包括使靶分子固定在比色共振反射生物传感器表面上并测定第一峰波长值；将小分 子加到比色共振反射生物传感器表面上并测定第二峰波长值；对第一峰波长和第二峰波长 进行比较，如果第二峰波长值与第一峰波长值相比发生位移，则小分子与靶分子结合。可测 出小分子的解离常数(Kd)。小分子的解离常数可约为2，000iiM至约750iiM。小分子的浓 度可约为0. 5mM至约0. OlmM。 因此，本专利技术可以测定与靶生物分子结合的、本领域技术人员称之为碎片的极低 分子量化合物。本专利技术方法较之用于定量测定和定性测定碎片分子与靶生物分子相互作用 以及用于测定碎片分子其它性质的典型生物化学试验法的精确性更高。比起通常相同应用 的传统方法(例如NMR波谱法、x-射线晶体学检测法或热量法)，本专利技术方法更经济，耗时 更少，需要的试剂更少。 附图详述 附图说明图1显示用于灵敏检测小分子与靶表面弱缔合的生物传感器的再现性。 图2显示当以相同浓度加到对照表面或封闭表面(x轴)和靶表面(y轴)上时，与靶表面(y轴)相比，聚集化合物和miso错配化合物在两种表面上提供显著不同的信号。 图3显示可应用本专利技术的方法进行滴定获得已知结合化合物的理想的亲和力结 合曲线，该结合化合物通过其它生物物理方法获得。 图4表明本专利技术的方法能够测定弱缔合碎片与不同结合位点的结合。 图5显示用于确定特异性的结合时程实验。 专利技术详述 本专利技术的一个实施方案可供在不需要掺入放射性标记、比色标记或荧光标记的情 况下，甚至在结合性相互作用非常弱的情况下，应用生物传感器(例如比色共振反射生物 传感器)直接测定小分子(亦称碎片)与靶分子的结合。可采用高速高分辨仪器，例如BIND Scanner (即比色共振反射生物传感器系统)，并应用量化数据的相应算法，对结合进行实 时检测。参见例如美国专利申请号6， 951， 715和美国专利公开文本2004/0151626。将这样 的方法、仪器和计算分析结合起来，可以无标记的方式、甚至在结合非常弱情况下，方便地 实时监测小分子与靶分子的结合。 生物传感器 本专利技术的生物传感器可以是比色共振反射生物传感器。参见例如Cu皿ingham等，"Colorimetric resonant reflection as a direct biochemicalassay technique (用作 直接生化实验技术的比色共振反射)"，Sensorsand Actuators B，第81巻，第316-328页， 2002年1月5日；美国专利公开号2004/0091397。比色共振生物传感器并非表面等离振子 共振(SPR)生物传感器。SPR生物传感器有一层薄的金属层，例如银、金、铜、铝、钠和铟。金 属必须具有能够与合适波长的光共振的导带电子。暴露于光的SPR生物传感器表面必须为 纯金属。氧化物、硫化物和其它薄膜干扰SP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定小分子对靶分子的亲和力的方法，其中该方法包括：　　（ａ）使靶分子固定在比色共振反射生物传感器表面上并测定第一峰波长值；　　（ｂ）将小分子以３种以上不同的浓度加到比色共振反射生物传感器表面并测定所述３种以上不同浓度的峰波长值；对峰值波长进行比较以确定小分子对于靶分子的亲和力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：L莱恩，R沃纳，
申请(专利权)人：SRU生物系统公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]