经工程改造的酶活性改善的聚唾液酸转移酶制造技术

本发明专利技术涉及溶解性和活性改善的聚－唾液酸转移酶多肽，和利用该聚－唾液酸转移酶产生聚唾液酸终末产物如寡糖、糖蛋白和糖脂的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交互参考本申请要求2007年6月15日提交的美国临时专利申请号60/944,391和2008年2月29日提交的美国临时专利申请号61/032,589的优先权，此二专利申请的内容为了所有目的通过引用纳入本文。专利
本专利技术涉及溶解性和活性改善的的聚-唾液酸转移酶(PST)多肽，以及利用该聚-唾液酸转移酶产生聚唾液酸终末产物，如寡糖、糖蛋白和糖脂的方法。专利技术背景哺乳动物细胞的细胞表面存在糖蛋白、糖脂和多糖，在许多生物学活动中是中心分子。它们参与了整个生物学过程中的细胞间识别、细胞分化和各种受体-配体相互作用。这些生物学活性聚糖中许多都含有必需的9-碳糖，称为唾液酸或N-乙酰基-神经氨酸(NeuAc)。某些细菌病原体能入侵哺乳动物宿主是利用了宿主中存在的含唾液酸的糖偶联物。这些细菌的细胞表面显示有某些相同的糖链，业已证明这些糖在致病机制中的确具有作用。参见例如，Kahler，C.M和Stephens，D.S.，Crit RevMicrobiol，24：281-334(1998)和Moran，A.P.等，FEMS Immunol Med Microbiol，16：105-115(1996)。认为存在的这类糖模拟物能使病原菌逃脱免疫系统的监测，因为这些分子不被认为是异物。另外，存在的这些糖提供了阻止血清补体杀伤作用的物理屏障。参见例如，Vogel，U等，Med Microbiol Immunol(Brel)，185：81-87(1996)。最后，有可能某些病原体能利用识别其表面糖结构的人正常受体作为帮助其传播(或寄居宿主，虽然对于许多这些病原菌而言这种机制未被证实)的工具。参见例如，Preston，A等，Crit Rev Microbiol，22：139-180(1996)和Harvey，H.A.等，Mol Microbiol，36：1059-1070(2000)。B群奈瑟脑膜炎球菌和大肠杆菌K1的夹膜多糖连接键中具有唾液酸，是主要见于哺乳动物神经细胞粘附分子，一种整合了神经原功能的脑特异性蛋白中的聚唾液酸(PSA)结构的分子模拟物。发现它们是α-2，8-连接的Neu5Ac的均聚体，也是α-2，9-连接残基的均聚体，是混合的α-2，8/α-2，9连接键的共聚体，最后是包含在Y群和W群奈瑟脑膜炎球菌中的其它糖的聚合物。对于大肠杆菌、奈瑟脑膜炎球菌和溶血性巴斯德菌(P.haemolytica)，神经侵入性疾病需要这些聚唾液酸夹膜。参见例如，Silver，R.P.和E.R.Vimr.1990，“大肠杆菌K1的聚唾液酸夹膜”，刊登在B.H.Iglewski和V.L.Clark主编的《微生物发病机制的分子基础》(“Molecular basis of Microbial Pathogensis”)，第39-60页，哈里弗圣地亚哥的学术出版社(Academic Press，San Diego，Calif)。重要的是须注意，因为许多这些病原菌是人宿主特异性的，故动物感染模型获得的数据不能显示这些糖偶联物所具有的真实功能。迄今对细菌病原体唾液酸转移酶的酶学基础方面的详细研究极少。已有可能表达、纯化和结晶负责LOS唾液酸化的一些酶。参见例如，Gilbert，M.等，J Biol Chem，-->271；28271-28276(1996)；Gilbert，M.等，J Biol Chem，275；3896-3906(2000)；Chiu，C.P.等，Nat.Struct.Mol.Biol.，11：163-170(2004)和Yu，H.等，J.Am.Chem.Soc.，127：17618-17619(2005)。然而，这些都没有对参与唾液酸均聚体夹膜生成的那些酶进行研究。已在大肠杆菌和奈瑟脑膜炎球菌中鉴定到产生PSA夹膜的基因位点，并对大肠杆菌K1和K92重组酶(NeuS)做了一些研究。参见例如，以Cho，J.和Troy FA，I.I.，PNAS，91：11427-11431(1994)和Shen，G.J.等，J.Biol.Chem.，274：35139-35146(1999)。但也还没有关于分离的唾液酸转移酶的详细酶学研究报告。该酶的溶解性差防碍了体外产生聚唾液酸偶联物因而阻碍了其酶学研究。本专利技术解决了此问题和其它需要。专利技术概述本专利技术提供可将唾液酸分子从供给底物转移到合适的接受底物的截短的聚唾液酸转移酶(PST)多肽。在一实施方式中，该截短PST多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID No：1的氨基酸33-495有95％相同。在另一实施方式中，该截短PST多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID No：1的氨基酸20-495有95％相同。优选地，该截短PST多肽比SEQ ID No：1的氨基酸1-495构成的全长PST多肽更易溶解。本专利技术的截短PST多肽不包含SEQ ID No：1的氨基酸1-495构成的氨基酸序列。一方面，该截短PST多肽包含MBP标签。另一方面，该截短PST多肽唾液酸化的接受底物是例如糖肽、糖蛋白、糖脂或神经节苷脂。另一方面，所述接受底物是糖蛋白，如因子IX、红细胞生成素(EPO)、转铁蛋白和胎球蛋白。在优选实施方式中，所述糖蛋白底物是人蛋白。本专利技术提供产生聚唾液酸化产物糖的方法，该方法包括使接受底物如寡糖或糖接触截短的PST多肽和含唾液酸部分的供给底物，以及使唾液酸部分转移给接受糖，从而产生聚唾液酸化的产物糖。本专利技术提供产生聚唾液酸化蛋白或肽的方法，该方法包括使接受底物如合适的蛋白或肽接触截短的PST多肽和含唾液酸部分的供给底物，以及使唾液酸部分转移给接受糖，从而产生聚唾液酸化的蛋白或肽。本专利技术提供产生聚唾液酸化糖脂或神经节苷脂的方法，该方法包括使接受底物如合适的糖脂或神经节苷脂接触截短的PST多肽和含唾液酸部分的供给底物，以及使唾液酸部分转移给接受糖，从而产生聚唾液酸化糖脂或神经节苷脂。附图简要说明图1是N-末端截短的PST的SDS-PAGE分析。分析了PST-13(MalE-全长PST)、PST-29(MalE-PST-Δ19)和PST-30(MalE-PST-Δ32)的溶解性。“P”表示颗粒组分，“S”表示上清液(可溶性)组分。图2提供PST唾液酸转移酶反应的代表性毛细管电泳(CE)的电泳图。分析了PST-13(MalE-全长PST)、PST-29(MalE-PST-Δ19)和PST-30(MalE-PST-Δ32)经27,000x g离心后的上清液(S)和颗粒(P)。转化百分比指所述底物转化为任何唾液酸化形式的百分比。图3提供了PST-13(MalE-全长PST)、PST-29(MalE-PST-Δ19)和PST-30(MalE-PST-Δ32)经27,000x g离心后1/10稀释上清液的代表性CE分析。转化百分比指所述底物转化为任何唾液酸化形式的百分比。CE线的顺序从上到下与-->PST-13(MalE-全长PST)、PST-29(MalE-PST-Δ19)和PST-30(MalE-PST-Δ32)相对应。图4显示纯化的PST-13(MalE-全长PST)、PST-29(MalE-PST-Δ19)和PST-30(MalE-PST-Δ32)的代表性SDS-PAGE。箭头指出的是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种聚唾液酸转移酶（ＰＳＴ）多肽，其包含的氨基酸序列与ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：３或ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：５有９５％相同；其中，所述ＰＳＴ多肽能将供给底物的唾液酸部分转移给接受底物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-6-15 60/944,391;US 2008-2-29 61/032,5891.一种聚唾液酸转移酶(PST)多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID No：3或SEQ ID No：5有95％相同；其中，所述PST多肽能将供给底物的唾液酸部分转移给接受底物。2.如权利要求1所述的PST多肽，其特征在于，所述PST多肽的溶解性比SEQ ID No：1的氨基酸1-495构成的全长PST多肽更好。3.如权利要求1所述的PST多肽，其特征在于，所述PST多肽不含SEQID No：1的氨基酸1-495构成的氨基酸序列。4.如权利要求1所述的PST多肽，其特征在于，所述多肽还含有MBP标签。5.如权利要求1所述的PST多肽，其特征在于，所述接...

【专利技术属性】
技术研发人员：W瓦卡丘克，E维利斯，M吉尔伯特，
申请(专利权)人：加拿大国家研究院，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]