含核酸的复合物制造技术

本发明专利技术公开了一种含核酸复合物，该复合物含有核酸和生物可降解聚合物，尤其是带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物。该复合物具有向需治疗的位点持续释放目的核酸，尤其是ＤＮＡ的优秀性质。由于该复合物可以被吞噬细胞例如巨噬细胞摄取，并特异地递送至靶位点，因此，可以以靶位点特异性方式展现核酸的功能，由此可以实现更特异的基因治疗。该复合物无不良作用，例如采用病毒载体如腺病毒、或脂质体所可能导致的重组或毒性的发生。因此，对于基因治疗领域，该复合物是尤其优选的。而且，该复合物可以增强导入细胞中的核酸的生物学作用，从而使得可以采用较低剂量的核酸进行基因治疗。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
含核酸的复合物的制作方法
技术介绍
专利
本专利技术涉及含核酸的复合物，其特征在于含有核酸和带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物，本专利技术还涉及控制复合物的核酸释放速率的方法。本专利技术还涉及包含有含核酸和生物可降解聚合物的含核酸复合物的吞噬细胞(phagocytic cells)(之后称作吞噬细胞(phagocytes))。本专利技术还涉及含有该含核酸复合物作为活性成分并且可以用于吞噬细胞介导的基因治疗的药物。相关领域描述近年来，随着人类疾病的分子遗传因素的明朗化，越来越多的重点被放在基因治疗研究上。基因治疗的目的是在靶位点或细胞表达DNA。对于该治疗，有利的是，直接将DNA带到靶位点或细胞处，使之有效地转移至靶位点或细胞中，并在特异位点或在细胞中作功能性表达。已经报道了多种用于有效转移和表达外源DNA的方法(Fumimaro Takaku编，“Idenshichiryo no SaizensenKisogijutu kara Rinsho Oyo made(基因治疗前沿，从基础技术到临床应用)”，Experimental Medicine，第12卷，第15期，1994；Robert E.Sobol和Kevin J.Scanlon，基因治疗的互联网书籍(The Internet Book of Gene Therapy)，Appleton&LangeStamford，Connecticut，1995)。可以将它们粗略地分为(1)用于DNA转移的物理方法(显微注射、电穿孔)、(2)用于DNA转移的化学方法(磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖转染)、和(3)生物学方法(病毒载体，如逆转录病毒载体和腺病毒载体)。一般地，现有化学方法，如磷酸钙转染和DEAE-葡聚糖转染，的基因转移效率低。物理方法，如显微注射和电穿孔，可能要求特殊的设备，并且它们对于常规临床使用是不实际的。由于病毒载体的高基因转移效率，人们期望发现它的临床用途。然而，由于它们的病毒本质，这些载体有产生不良反应如免疫反应的危险。为了克服以上缺点，已开发了新的技术。脂质体方法将基因掺入脂质体中以保护基因免遭失活或降解。脂质体不含病毒DNA，由此排除了发生潜在的危险重组事件的可能性。然而，它们对多种细胞类型具有的强毒性限制了脂质体作为DNA载体的用途。甚至现在新的基因递送物质和手段仍在不断的开发中。在血管损伤的基因治疗领域，还开发了所谓的水凝胶法，该方法包括将水凝胶附着在待导入血管的导管的表面、将质粒基因放置在该水凝胶中、并直接将该水凝胶涂在血管内(Marchall，E.，Science，269，1050-1055，1995)。根据该方法，质粒通过简单扩散缓慢地从水凝胶中释出。采用该方法，一般而言，缓释期短，且难于控制该时期的释放速率和时间长度。基因治疗要求治疗性基因的量或其供给期可以随待治疗的疾病或疾病的状态得到调节。因此，需要一种方法能够根据治疗的要求控制治疗性基因的缓释期。当在临床背景如基因治疗中使用外源基因时，以稳定水平持续向靶位点提供该基因是该基因进行功能性表达所必需的。而且，对采用反义寡核苷酸进行的基因治疗的研究近年来已吸引了人们的注意力。在受控的时间期内位点特异性地体内稳定提供这些核酸的手段将增加该方法的有效性。专利技术概述本专利技术的一个目的是提供安全的、可以高效地将核酸导入细胞、并能够向靶位点持续提供核酸的含核酸复合物，以及提供方法控制该含核酸复合物的核酸释放速率。本专利技术的另一目的是提供安全、易于操作且擅长体内位点特异性功能表达的含核酸复合物，以及采用该含核酸复合物可以特异地在靶位点展示核酸的功能的方法。本文所用短语“核酸的功能”是指核酸所编码的基因的表达，但它也可以指直接发挥作用的核酸。直接发挥作用的核酸的例子包括反义核苷酸(Robert E.Sobol和Kevin J.Scanlon，基因治疗互联网书籍，Appleton&Lange Stamford，Connecticut，1995)、核酶(美国专利6,127,173)、能够发挥诱铒作用的双链DNA分子(Sobol，同上)、和DNA/RNA杂合体(Bartlett等，(2000)Nat.Biotech.18615)。根据这些目的，本专利技术的专利技术人进行了深入的研究并获得了下列发现。首先，通过将带负电荷的核酸和带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物复合在一起形成稳定的复合物，可以抑制核酸的体内降解，并且可以在期望的靶位点或细胞处以恒定的速率释放该核酸。其二，通过核酸和生物可降解聚合物的复合获得的复合物，如本文所述含核酸的复合物，可以容易地被免疫系统中扮演着重要角色的吞噬细胞摄取(首先，复合物靶向吞噬细胞)。摄取了复合物的吞噬细胞迁移至靶位点(其次，吞噬细胞靶向靶位点)，由此吞噬细胞通过使所加入核酸的作用靶向靶位点而增加该技术的有效性。基于这些发现，本专利技术人完成了本专利技术。一方面，本专利技术涉及含有核酸和带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物的含核酸复合物，其中该核酸可以通过该生物可降解聚合物的降解得到释放。另一方面，本专利技术涉及含有核酸和在聚合物中加入了带正电荷基团的带正电荷水不溶性生物可降解聚合物的含核酸复合物。在本专利技术的含核酸复合物中，该带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物含有至少一个选自下组的成员胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、褐藻酸、淀粉、和所有这些物质的衍生物。优选地，该衍生物是氨基衍生物。在一个优选实施方案中，该带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物是具有引入的带正电荷基团的交联明胶。在另一优选实施方案中，该核酸是至少一个选自下组的成员质粒DNA、寡核苷酸、和双链核酸化合物。在一个优选实施方案中，该核酸编码多肽，其包含至少一个选自下组的成员血管内皮生长因子基因、肝细胞生长因子基因、和成纤维细胞生长因子基因、以及其它基因如激酶、磷酸酶、转录因子、细胞因子、蛋白酶、细胞凋亡诱导因子和细胞凋亡阻滞因子。更优选地，该DNA包含序列表中SEQ ID NO.1所示编码FGF4/HST1的碱基序列。另一方面，本专利技术涉及包含本专利技术的含核酸复合物作为活性成分的药物组合物。在一个优选实施方案中，该药物组合物被用于基因治疗，尤其是通过局部施用基因进行的基因治疗。再一方面，本专利技术涉及控制核酸释放速率的方法，其特征在于将核酸掺入带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物中、并通过该生物可降解聚合物的降解释放该核酸。另一方面，本专利技术涉及控制核酸释放速率的方法，其特征在于将核酸掺入具有引入的带正电荷基团的带正电荷水不溶性生物可降解聚合物中，并通过该生物可降解聚合物的降解释放该核酸。另一方面，本专利技术涉及增强核酸的功能性表达的方法，其特征在于将核酸掺入带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物中，并通过该生物可降解聚合物的降解释放该核酸，以展示核酸的功能。本专利技术还涉及增强核酸的功能性表达的方法，其特征在于将核酸掺入具有引入的带正电荷基团的带正电荷水不溶性生物可降解聚合物中，并通过该生物可降解聚合物的降解释放该核酸，以展示核酸的功能。在一个优选实施方案中，带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物具有至少一个选自下组的成员胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、褐藻酸、淀粉、和所有这些物质的衍生物(例如氨基衍生物)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含核酸和带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物的含核酸复合物，其中所述核酸可以通过生物可降解聚合物的降解得以释放。

【技术特征摘要】
JP 1999-11-9 318187/99;JP 2000-9-13 278878/001.包含核酸和带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物的含核酸复合物，其中所述核酸可以通过生物可降解聚合物的降解得以释放。2.包含核酸和带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物的含核酸复合物，其中该聚合物具有引入的带正电荷基团。3.权利要求1或2的含核酸复合物，其中所述带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物包含至少一个选自下组的成员胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、褐藻酸、和它们的衍生物。4.权利要求3的含核酸复合物，其中所述衍生物包含氨基衍生物。5.权利要求1或2的含核酸复合物，其中所述带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物包含具有引入的带正电荷基团的交联明胶。6.权利要求1或2的含核酸复合物，其中所述核酸包含至少一个选自下组的成员质粒DNA、寡核苷酸、和双链核酸化合物。7.权利要求6的含核酸复合物，其中所述核酸包含至少一个选自下组的成员血管内皮细胞生长因子基因、肝细胞生长因子基因、和成纤维细胞生长因子基因。8.权利要求7的含核酸复合物，其中所述成纤维细胞生长因子基因包含SEQ ID NO.1。9.包含权利要求1-8之任一项的含核酸复合物作为活性成分的药物组合物。10.权利要求9的药物组合物，其被用于基因治疗。11.权利要求10的药物组合物，其中所述基因治疗通过局部施用该基因来实现。12.控制核酸释放速率的方法，包括将核酸掺入带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物中；和允许核酸通过所述生物可降解聚合物的降解得到释放。13.控制核酸释放速率的方法，包括将核酸掺入具有引入的带正电荷基团的带正电荷水不溶性生物可降解聚合物中；和允许核酸通过所述生物可降解聚合物的降解得到释放。14.权利要求12或13的方法，其中所述带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物包含至少一个选自下组的成员胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、褐藻酸、淀粉、和它们的衍生物。15.权利要求14的方法，其中所述衍生物包含氨基衍生物。16.权利要求12或13的方法，其中所述带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物包含具有引入的带正电荷基团的交联明胶。17.权利要求12或13的方法，其中所述核酸包含至少一个选自下组的成员质粒DNA、寡核苷酸、和双链核酸化合物。18.权利要求17的方法，其中所述核酸包含至少一个选自下组的成员血管内皮细胞生长因子基因、肝细胞生长因子基因、和成纤维细胞生长因子基因。19.权利要求18的方法，其中所述成纤维细胞生长因子基因包含含有SEQID NO.1的DNA。20.增强核酸的功能的方法，包括将核酸掺入带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物中；和允许该核酸通过生物可降解聚合物的降解得以释放，以表现出该核酸的功能。21.增强核酸的功能的方法将核酸掺入具有引入的带正电荷基团的带正电荷水不溶性生物可降解聚合物中；和允许该核酸通过该生物可降解聚合物的降解得以释放，以表现出该核酸的功能。22.权利要求20或21的方法，其中所述带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物包含至少一个选自下组的成员胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、海藻糖、和它们的衍生物。23.权利要求22的方法，其中所述衍生物包含氨基衍生物。24.权利要求20或21的方法，其中所述带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物包含具有引入的带正电荷基团的交联明胶。25.权利要求20或21的方法，其中所述核酸包含至少一个选自下组的成员质粒DNA、寡核苷酸、和双链核酸化合物。26.权利要求25的方法，其中所述核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛英三，田畑泰彦，安藤洁，田中越郎，井关治和，坂本裕美，福山直人，笠原启史，
申请(专利权)人：盛英三，田畑泰彦，
类型：发明
国别省市：JP[日本]