用于检测疟原虫的引物制造技术

本发明专利技术提供用于检测／鉴定人样品中是否存在特定疟原虫属寄生虫和疟疾寄生虫的四个种的容易且快速的方法、抗疟疾措施支持系统和疟疾感染－预防／治疗系统，它们可有助于疟疾流行区的实际诊断。根据本发明专利技术，使用能够同时检测四种感染人体的疟原虫属寄生虫的属特异性引物组，和分别对疟原虫属寄生虫的四个种（恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫）特异性的引物组，可以容易且快速地检测／鉴定是否存在这些寄生虫的感染。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能够快速和准确地检测/鉴定疟疾流行区的疟原虫属疾疾寄生虫的引物组、其^r测和鉴定方法、其^r测试剂盒、抗疟疾 措施支持系统，和疟疾感染-预防/治疗措施系统。
技术介绍
在许多疟疾寄生虫流行的国家，快速和准确地诊断疟疾寄生虫 是一项挑战。在疰原虫属的四个种中，恶性疾原虫(Plasmodium falciparum)可能是致命的，必须迅速鉴定且从其他对人类致病的疟 原虫种中区分出来(Moody, A., Clin. Microbiol. Rev. 15 (2002): 66-78)。另外，大多数疟疾流行区典型的感染涉及两种或多种上述的种； 这些混合感染经常认识不到或被低估(Zimmerman, P.A.等人，Trends Parasitol. 20 (2004): 440-447)。混合感染检测的失败会导致治疗不充 分，以及可能会导致严重的疾病(Mayxay, M.等人，Trends Parasitol. 20 (2004): 233-240)。因此，亟需发展一种在痴疾流行区可行的、简 便、快速、高灵敏度和种特异性的疟疾诊断方法。目前痴疾的简便诊断方法是血涂片的显微镜检。如果寄生虫密 度很高，这种显微镜检具有相对较高的灵敏度和特异性并且能够确 定发展阶段和种。然而，在寄生虫密度通常较低的流行区，该方法 比较繁瑣，需要训练良好的专家，并且可能导致治疗上的延误。在一些标准实验室诊断无法开展的地区，为提高疟疾诊断的速 度和精确性，研究者们开发了基于免疫反应的痴疾快速诊断试验 (RDT)(Moody, A. Clin. Microbiol. Rev. 15 (2002): 66-78; Ndao, M.等 人，J. Clin. Microbiol. 42 (2004): 2694-2700)。然而，产品间的灵敏度有波动(Murray, C. K.等人，Trop. Med. Int. Health. 8 (2003): 876-883)， 并且只有对恶性疟原虫的种特异性的产品。在以下几种情形下需要 极长的观察时间和较多的技巧来通过显微镜检校正诊断当寄生虫 血症呈低度时、在混合感染期间、在药物治疗之后、和在感染慢性 期过程中。因此，这种状况可导致假阴性结果或不可靠的种诊断 (Coleman, R.等人,Thailand. Malar. J. 14 (2006): 121)。后来，开发出了用于疟疾诊断的基于DNA扩增的分子生物学方 法，如套式PCR和实时定量PCR。与显微镜检相比，这些方法被证 明对于混合感染具有较高的灵敏度和较好的特异性(Kimura， K.等 人，Parasitol. Int. 46 (1997): 91-95; Perandin, F.等人,J. Clin. Microbiol. 42 (2004): 1214-1219; Rougemont, M.等人，J. Clin. Microbiol. 42 (2004): 5636-5643; Singh, B.等人,Am. J. Trop. Med. Hyg. 60 (1999): 687-692; Singh, B.等人，Lancet. 363 (2004): 1017-1024; S麵画,G.等 人，Mol. Biochem. Parasitol. 58 (1993》283-292; S醒顏，G.等人， Mol. Biochem. Parasitol. 61 (1993): 315-320)。然而，较长的运转时间、 高成本、和仅能在装备良好的实验室进行使得该PCR技术无法胜任 医院实验室和流行区的现场诊所的常规i诊断(Hanscheid, T.和 Grobusch， M. P.， Trends Parasitol, 18 (2002): 395-398)。关于疟疾4企测，专利文件1的实施例8和1(V^开了一种,人血液 样品中提取核酸和进行套式PCR来检测痴原虫属的四个种的方法。 实施例8公开了每个正向引物和反向引物序列，它们与本专利技术的引 物序列不同(专利文件1)。专利文件2和4的专利公开文本公开了基于固相方法或套式 PCR检测一种或多种疾疾感染的方法，其中使用多种类型引物中的 一个或多个进行恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原 虫的临床检测。然而，这些引物与本专利技术的引物具有不同的引物序 列。专利文件3的专利公开文本公开了一种检测恶性疾原虫和/或间 日痴原虫的方法，其中恶性痴原虫和/或间日症原虫特异性引物结合10于标记物或固相支持物上。然而，这些特异性引物序列不同于本发 明引物组的寡核苷酸序列。最近，开发出了一种新型、简便和高灵敏度的技术，称为环介导的等温扩增(LAMP) (Notomi， T.等人，Nucleic Acids Res. 28 (2000): e63; WO 2000/28082)。LAMP是一种核酸扩增方法，它依赖于由Bst DNA聚合酶运行 的自动循环链置换DNA合成。扩增产物为具有靶标的几个重复序列 的茎环结构，并且具有多个环。该法的主要优点是不需要DNA模板的变性(Nagamine， K.等人， Clin. Chem. 47 (2001): 1742-1743),并且因此LAMP反应可以在等温 条件下运行(范围从60。C至65°C)。 LAMP仅需一种酶和四种类型的 能够识别六个不同耙区域的引物。该方法产生大量的扩增产物，使 得检测十分容易，如通过目视判断反应混合物的浊度或荧光进行检 测(Mori， Y.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (2001): 150-154)。使用荧光物质如荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC) 、 X-罗丹明(ROX)或类似物来测量反应混合物的荧光极性值的LAMP, 以及使用SYBRGreen2 (—种绿色染料)作为嵌入剂的LAMP是已 知的(日本未审查的专利公开No. 2002-272475,和 WO 2002/103053)。几名研究人员已经报道了 LAMP方法在快速鉴定疟原虫、锥虫 (Trypanosoma)、 巴贝虫(Babesia)、镰孢霉(Fusarium)、李斯特氏菌 (Listeria)和军团菌(Legionella)中的应用，并且推荐了 LAMP试验的 有效性(Ikadai， H.等人，J. Clin. Microbiol. 42 (2004): 2465-2469; Kuboki， N.等人，J. Clin. Microbiol. 41 (2003): 5517-5524; Thekisoe, O. 等人，Mol. Biochem. Parasitol. 122 (2002): 223-236;日本未审查的专 利公开No. 2005-245257，日本未审查的专利公开No. 2007-61061， 日本未审查的专利公开No. 2003-219878和Poon, L.等人，Clin. Chem. 52 (2006): 303-306)。对于恶性疟原虫4企测，Poon等人估计运行LAMP试验的成本大约是标准PCR的十分之一 (Poon， L.等人，Clin. Chem. 52 (2006): 303-306本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测或鉴定标本中疟原虫属和／或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的一种或多种疟原虫的感染的方法；该方法包括以下步骤（ａ）至（ｃ）：　ａ）从标本中提取ＤＮＡ；　ｂ）通过使步骤（ａ）中提取的ＤＮＡ在含有链置换ＤＮＡ聚合酶和 序列特异性引物组的反应混合物中进行反应，来扩增疟原虫属１８ＳｒＲＮＡ基因序列的特定区域；和　ｃ）检测或鉴定在步骤（ｂ）中扩增的疟原虫属和／或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的一种或多种疟原虫的扩增产物的存在与否；　所述序 列特异性引物组是含有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１至６表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增疟原虫属１８Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列的特定区域；和／或以下引物组中的一个或多个：包含含有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７至１２表示的核酸序列的寡核苷酸组的引物组，用于扩增恶性疟原虫１８ＳｒＲＮＡ基因序列的特定区域；包含含有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３至１８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１至３６或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７至４２表示的核酸序列的寡核苷酸组的引物组，用于扩增间日疟原虫１８Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列的特定区域；包含含有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９至４２表示的核酸序列的寡核苷酸组的引物组，用于扩增三日疟原虫１８Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列的特定区域；和包含含有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５至３０表示的核酸序列的寡核苷酸组的引物组，用于扩增卵形疟原虫１８Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列的特定区域。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2007-5-28 140525/20071.一种检测或鉴定标本中疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的一种或多种疟原虫的感染的方法；该方法包括以下步骤(a)至(c)a)从标本中提取DNA；b)通过使步骤(a)中提取的DNA在含有链置换DNA聚合酶和序列特异性引物组的反应混合物中进行反应，来扩增疟原虫属18SrRNA基因序列的特定区域；和c)检测或鉴定在步骤(b)中扩增的疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的一种或多种疟原虫的扩增产物的存在与否；所述序列特异性引物组是含有SEQ ID NO1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增疟原虫属18S rRNA基因序列的特定区域；和/或以下引物组中的一个或多个包含含有SEQ ID NO7至12表示的核酸序列的寡核苷酸组的引物组，用于扩增恶性疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域；包含含有SEQ ID NO13至18、SEQ IDNO31至36或SEQ ID NO37至42表示的核酸序列的寡核苷酸组的引物组，用于扩增间日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域；包含含有SEQ ID NO19至42表示的核酸序列的寡核苷酸组的引物组，用于扩增三日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域；和包含含有SEQ ID NO25至30表示的核酸序列的寡核苷酸组的引物组，用于扩增卵形疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。2. 根据权利要求1所述的才全测或鉴定方法，其中从标本中提取 DNA是通过煮沸含有该DNA的标本并进行离心来完成的。3. 根据权利要求2所述的检测或鉴定方法，其中煮沸时间是从 数分钟至十数分钟。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的检测或鉴定方法，其中， 在扩增疟原虫属18S rRNA基因序列的特定区域的步骤(b)中，使用恒温水浴或特别为LAMP设计的扩增仪，在大约60。C下进行所述 DNA扩增反应大约1小时。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的检测或鉴定方法，其中， 在步骤(C)中，利用目视观察或实时浊度计检测或鉴定疰原虫属和/ 或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的一种或 多种疟原虫的扩增产物的存在与否。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的检测或鉴定方法，其在 疾疾流4亍区进4亍。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的检测或鉴定方法，其中 同时或分别检测或鉴定痴原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三 日症原虫和卵形痴原虫中的一种或多种痴原虫的感染。8. 根据权利要求1至6中任一项所述的检测或鉴定方法，其中 使用一个引物组作为序列特异性引物组来检测或鉴定疟原虫属的感 染，该引物组包含含有SEQIDNO: 1至6表示的核酸序列的寡核苷 酸组，用于扩增疟原虫属18SrRNA基因序列的特定区域。9. 根据权利要求1至6中任一项所述的检测或鉴定方法，其中 使用用于检测间日疟原虫的引物组作为序列特异性引物组来检测或 鉴定间日疟原虫的感染，该引物组包含含有SEQIDNO: 13至l8、 SEQ ID NO: 31至36或SEQ ID NO: 37至42表示的核酸序列的寡核 苷酸组并且能够扩增间日疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域。10. 根据权利要求1至6中任一项所述的检测或鉴定方法，其中 使用用于检测三日疟原虫的引物组作为序列特异性引物组来^r测或 鉴定三日疾原虫的感染，该引物组包含含有SEQIDNO: 19至24表 示的核酸序列的寡核苷酸组并且能够扩增三日疟原虫18S rRNA基 因序列的特定区域。11. 根据权利要求1至6中任一项所述的检测或鉴定方法，其中 使用用于检测卵形疟原虫的引物组作为序列特异性引物组来检测或 鉴定卵形疟原虫的感染，该引物组包含含有SEQIDNO:25至30表 示的核酸序列的寡核苷酸组并且能够扩增卵形疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域。12. —种用于检测疟原虫属的引物组，其包含含有SEQ ID NO: 1 至6表示的核酸序列的寡核香酸组，该引物组能够扩增疟原虫属18 S rRNA基因序列的特定区域。13. —种用于检测间日疰原虫的引物组，其包含含有SEQ ID NO: 13至18、 SEQ ID NO: 31至36或SEQ ID NO: 37至42表示的核酸 序列的寡核苷酸组，该引物组能够扩增间日疟原虫18SrRNA基因序 列的特定区域。14. 一种用于检测三日疾原虫的引物组，其包含含有SEQ ID NO: 19至24表示的核酸序列的寡核苦酸组，该引物组能够扩增三日疟原 虫18SrRNA基因序列的特定区域。15. —种用于检测卵形疟原虫的引物组，其包含含有SEQ ID NO: 25至30表示的核酸序列的寡核苷酸组，该引物组能够扩增卵形疟原 虫18SrRNA基因序列的特定区域。16. —种用于^r测疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三 日疾原虫和卵形痗原虫中的任一种的引物组，其包含含有选自权利 要求12至15中所述的核酸序列和SEQ ID NO: 7至12表示的核酸 序列的核酸序列的寡核苷酸引物组，该引物组能够扩增疟原虫属以 及疾原虫属的各个种的18SrRNA基因序列的特定区域，包括恶性疟 原虫18SrRNA基因序列的特定区域。17. —种用于症原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟 原虫和卵形症原虫中的任一种的检测试剂盒，其包含选自权利要求 12至16所述的引物组的至少一个引物组、链置换DNA聚合酶、 dNTPs和反应緩冲液。18. 根据权利要求17所述的检测试剂盒，其中该...

【专利技术属性】
技术研发人员：坪井敬文，韩银泽，
申请(专利权)人：国立大学法人爱媛大学，大塚制药株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]