用于多基因表达的载体制造技术

本发明专利技术提供用于表达至少第一和第二核酸分子的载体，其中所述第一和第二核酸分子在４０个或更多个连续核苷酸的部分显示大约８０％或大于８０％的同源性百分比，并且中所述第一核酸分子和／或所述第二核酸分子被修饰，以使得所述的同源性百分比减低至小于７５％。本发明专利技术也涉及基本上分离的核酸分子，其包含如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９－１５和６６－６９任一所定义的核苷酸序列。还提供包含此种核酸分子或载体的宿主细胞和药物组合物以及它们用于治疗或预防目的的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于多基因表达的载体本专利技术涉及改造用于独立表达多个目的核苷酸序列的重组载体，其中所述目的核苷酸序列获得自同一种生物体或从密切相关的生物体。本专利技术涉及在多种原核及真核体外系统或在动物或人类对象中表达彼此显示同源性的多个核苷酸序列用于治疗或预防性目的重组核酸
本专利技术特别用于免疫治疗领域，尤其用于治疗或预防因感染性生物如乳头状瘤病毒和肝炎病毒所致的病理状况。重组DNA技术己经使得在培养的宿主细胞或在活生物中表达核苷酸序列成为可能。已经产生几种质粒DNA和病毒载体并用于多种目的，包括免疫接种、基因治疗、免疫治疗和在培养的细胞中表达。载体如腺病毒的和痘病毒载体具有容纳巨大克隆容量的优点，具有在类型广泛的宿主细胞中表达多个核苷酸序列的潜能。表达多个核苷酸序列可以有利于改善由所编码的多肽提供的治疗效力(例如联合体液免疫及细胞免疫)。有利的是产生单个重组载体，而非产生分别改造以表达每种想要的核苷酸序列的多个重组载体，至少对于生产步骤和行政批准而言是有利的。例如，就乳头状瘤病毒感染而言，有意义的将是表达来自几种乳头状瘤病毒基因型的免疫原性多肽，旨在拓宽或增强宿主的免疫应答，尤其在面临多重感染(例如HPV-16和HPV-18)风险的对象中。然而，编码此类免疫原性多肽的核苷酸序列在相关HPV基因型之间是高度同源的。例如，在核苷酸水平显示63%的整体同源性的HPV-16 E6和HPV-18 E6序列反而包含具有超过75 %极高同源性的可以危及从单个载体表达HPV-16和HPV-18基因的特殊区域。另外，当表达病毒源多肽时，同源核苷酸序列也可以因病毒基因组的整体组织作用而产生。病毒通过生物学机制(如内部翻译起始或移码)使用相同核苷酸序列来编码两种不同蛋白质是相当频繁的，例如相同DNA的序列在多于一个可读框中翻译。例如，在HPV-16基因组中，毗邻的E1和E2基因具有59个核苷酸的重叠区，其在不同的可读框中被翻译。换句话说，El基因的最后59个核苷酸与E2基因的头59个核苷酸重叠。然而，预期载体中同源序列的存在不利地影响载体的稳定性，尤其在载体生产步骤期间，这导致基因序列丢失，原因在于同源序列之间出现的重组事件。因此，在单个载体中表达HPV-16E1和E2基因涉及59个核苷酸共同部分的存在，其中所述共同部分可能潜在地造成同源重组事件并且最终造成El与E2同源序列之间所包含的序列丢失。这类不希望的同源重组事件也可以在相同载体中表达HPV-16和HPV-18基因序列时发生。这种不稳定性问题可以导致载体原液不可用，尤其对于人类临床试验而言。在这个方面，W092/16636提出将同源核苷酸序列以彼此相反的方向插入重组载体中，从而降低重组事件的可能性。然而，该策略是就痘苗病毒载体进行描述的，没有对其他重组载体(如腺病毒)进行描述。另外，以相反方向排列并非总是可能的，原因在于可能的启动子干扰和构建限制。本领域需要产生能够在宿主细胞或对象中表达从同一种生物体或从密切相关的生物体所获得的核苷酸序列的重组载体，其中所述生物在天然环境下含有高度同源的部分。本专利技术通过提供一种新策略满足这种需求，所述策略被设计为旨在以如下方式使重组事件的可能性最小化，即利用遗传密码的简并性改变同源核苷酸序列两者之一或两者以使得它们的同源性比修饰前更少，同时不改变或不显著改变所编码的氨基酸序列。本专利技术允许避开同源重组的有害作用，其中所述有害作用可以在同源序列之间出现，尤其在载体生产步骤期间，并且导致同源序列之间所含有的核苷酸序列丢失。已经发现本专利技术的载体在表达天然环境下共同拥有59个核苷酸的100%同源部分的El和E2乳头状瘤病毒基因方面出人意料地有效并且在载体生产步骤期间出人意料地稳定。还发现本专利技术的载体在表达从密切相关的HPV-16和HPV-18基因型中获得的E6和E7基因方面出人意料地有效。这个技术问题通过提供如权利要求书中定义的实施方案加以解决。本专利技术的其他和另外方面、特征和优点将因以下对本专利技术当前优选实施方案的描述而显而易见。这些实施方案出于公开目的给出。因此，在第一方面，本专利技术提供载体，其至少包含编码第一多肽的第一核酸分子和编码第二多肽的第二核酸分子，其中-所述第一和第二核酸分子分别获得自第一和第二天然核酸序列，其中所述第一和第二天然核酸序列在一40个或更多个连续核苷酸的部分显示大约80%或大于80%的同源性百分比，禾口-在该载体中包含的所述第一核酸分子和/或所述第二核酸分子被修饰，以使得所述的同源性百分比减低至小于75%。如整个申请书范围内通篇所用，术语一(a和an)以如此含义使用，从而它们意指所指向的化合物或步骤的至少一个、至少第一个、一个或多个或多个，除非上下文另外申明。例如，术语一细胞包括多个细胞，包括其混合物。如论在本文中何处使用，术语和/或包括和、或和与该术语相联的要素的全部或任何其他组合的意思。例如，第一核酸分子和/或第二核酸分子意指第一核酸分子或第二核酸分子或第一以及第二核酸分子。如本文中所用的术语约或大约意指在给定值或区间的5%范围内，优选在4%范围内并且更优选在2%范围内。如本文中所用，当用来定义产物、组合物和方法时，术语包括意图指该产品、组合物和方法包括所指的组分或步骤，但不排除其他组分或步骤。基本上由......组成应当指排除任何具有重要意义的其他组分或步骤。因此，基本上由所提及组分组成的组合物将不排除痕量杂质和可药用载体。由......组成应当指将其他组分或步骤的更多痕量要素排除。例如，当多肽不含有除所提及氨基酸序列之外的任何氨基酸时，则该多肽由一个氨基酸序列组成。当多肽基本上由一个氨基酸序列组成时，这种氨基酸序列仅连同几个额外氨基酸残基，一般连同约1个至约50个或左右的额外残基一起存在。多肽包含一个氨基酸序列，当该氨基酸序列至少是此多肽的最终氨基酸序列的部分时。此种多肽可以具有几个直至几千个额外的氨基酸残基。此类额外的氨基酸残基可以在多肽转运方面发挥作用、促进肽产生或纯化、延长半寿期及其他作用。同理可以适用于核苷酸序列。如本文中所用，载体可以是能够送递并在宿主细胞或对象中表达至少第一和第二核酸分子的任意介质。载体可以是染色体外的(例如附加体)或整合的(用于并入宿主染色体)、自主复制或非自我复制的，多拷贝或低拷贝的，双链或单链的、裸露的或与其他分子复合的(例如与脂质或聚合物复合以形成颗粒结构(如脂质体、脂质复合体或纳米粒子)的载体、包裹在病毒衣壳内的载体和固定在固相粒子上的载体等)。术语载体，，的定义也包括已经被修饰以允许偏好地靶向特定宿主细胞的载体。靶向载体的一个特征性 特点是在其表面存在配体，其中所述配体能够识别并结合至细胞的且表面暴露的组分如细胞特异性标记(例如HPV感染的细胞)、组织特异性标记或 肿瘤特异性标记。该配体可以被遗传地插入在载体表面存在的多肽中(例 如，如WO94/10323和WO02/96939中描述的腺病毒纤突、五邻体、pIX或 如EP 1 146 125中描述的痘苗病毒p14基因产物)。在本专利技术的上下文中，术语核酸、核酸分子、多核苷酸和核苷 酸序列以互换方式使用并且定义了多脱氧核糖核苷酸(DNA)或多核糖核 苷酸(RNA)分子或其任意组合的任意长度的聚合物。该定义包括单链或双 链的、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种载体，其至少包含编码第一多肽的第一核酸分子和编码第二多肽的第二核酸分子，其中：　－所述第一和第二核酸分子分别获得自第一和第二天然核酸序列，其在一４０个或更多个连续核苷酸的部分显示大约８０％或大于８０％的同源性百分比，和　－该载体中包 含的所述第一核酸分子和／或所述第二核酸分子被修饰，以使得所述的同源性百分比减低至小于７５％。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2007-5-15 07360019.91.一种载体，其至少包含编码第一多肽的第一核酸分子和编码第二多肽的第二核酸分子，其中-所述第一和第二核酸分子分别获得自第一和第二天然核酸序列，其在一40个或更多个连续核苷酸的部分显示大约80％或大于80％的同源性百分比，和-该载体中包含的所述第一核酸分子和/或所述第二核酸分子被修饰，以使得所述的同源性百分比减低至小于75％。2. 根据权利要求1的载体，其中第一核酸分子或第二核酸分子或第一 和第二核酸分子的密码子使用模式至少在所述的40个或更多个连续核苷酸 同源部分内被修饰，以使得所述的同源性百分比减低至小于75%。3. 根据权利要求2的载体，其中密码子使用模式在核苷酸水平被修饰 并且所述的修饰在氨基酸水平是沉默的。4. 根据权利要求2或3的载体，其中密码子使用模式被修饰以使得第 一与第二核酸分子之间的同源部分限制在小于8个连续核苷酸。5. 根据权利要求4的载体，其中密码子使用模式被修饰以使得第一与 第二核酸分子之间的同源部分限制在小于5个连续核苷酸。6. 根据权利要求1至5任一项的载体，其中所述载体是腺病毒载体。7. 根据权利要求6的载体，其中所述腺病毒载体是复制缺陷型的。8. 根据权利要求1至5任一项的载体，其中所述载体是痘病毒载体。9. 根据权利要求8的载体，其中所述痘病毒载体从选自由哥本哈根株、 Wyeth株、NYVAC和高度减毒的改良Ankara (MVA)株组成的组中的痘苗 病毒获得。10. 根据权利要求1至9任一项的载体，其中第一和第二核酸分子独立 地编码选自由免疫原性多肽和抗肿瘤多肽组成的组中的多肽。11. 根据权利要求1至10任一项的载体，其中第一和第二核酸分子从 同一种生物体或从密切相关的生物体获得。12. 根据权利要求ll的载体，其中所述生物体是乳头状瘤病毒并且第 一和第二核酸分子中每一种核酸分子编码乳头状瘤病毒多肽。13. 根据权利要求12的载体，其中第一和第二核酸分子独立地从选自由HPV-16、 HPV画18、 HPV誦30、 HPV画31、 HPV画33、 HPV-35、 HPV-39、 HPV-45、 HPV-51、 HPV隱52、 HPV-56、 HPV-58、 HPV-59、 HPV-66、 HPV國68、 HPV-70和HPV-85组成的组中的高危型乳头状瘤病毒获得。14. 根据权利要求12或13的载体，其中第一和第二核酸分子独立编码 选自由E1、 E2、 E6和E7组成的组中的早期乳头状瘤病毒多肽。15. 根据权利要求12至14任一项的载体，其中第一核酸分子和第二核 酸分子编码从同一种HPV血清型获得的至少两种不同的乳头状瘤病毒多 肽。16. 根据权利要求15的载体，其中第一核酸分子编码El多肽并且第 二核酸分子编码E2多肽。17. 根据权利要求16的载体，其中第一核酸分子编码包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽并且第二核酸分子编码包含SEQ ID NO:7所 示氨基酸序列的多肽。18. 根据权利要求16的载体，其中第一核酸分子编码包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽并且第二核酸分子编码包含SEQ ID NO:8所 示氨基酸序列的多肽。19. 根据权利要求16至18任一项的载体，其中所述载体包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。20. 根据权利要求17或19的载体，其中第一核酸分子包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列并且其中第二核酸分子包含SEQ ID NO:12所示 的核苷酸序列。21. 根据权利要求18的载体，其中第一核酸分子包含SEQ ID NO:ll 所示的核苷酸序列并且其中第二核酸分子包含SEQ ID NO:13所示的核苷 酸序列。22. 根据权利要求20或21的载体，其中所述载体是MVA载体，第一 核酸分子置于痘苗病毒7.5K启动子的控制下并且第二核酸分子在痘苗病毒 H5R启动子的控制下，并且第一和第二核酸分子均插入所述MVA载体的 缺失III中。23. 根据权利要求16的载体，其中所述载体包含编码HPV-16E1多肽 的第一核酸分子、编码HPV-16 E2多肽的第二核酸分子、编码HPV-18E1 多肽的第三核酸分子和编码HPV-18 E2多肽的第四核酸分子，并且其中所述第一、第二、第三和第四核酸分子不包含显示75%或大于75%同源性百 分比的40个或更多个连续核苷酸的部分。24. 根据权利要求23的载体，其中所述HPV-16 El多肽包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述HPV-16 E2多肽包含SEQ ID NO:7所示的 氨基酸序列，所述HPV-...

【专利技术属性】
技术研发人员：N西尔韦斯特雷，D施密特，
申请(专利权)人：特兰斯吉恩股份有限公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]