本申请提供了一种免疫球蛋白文库。文库是由免疫球蛋白重链或轻链可变区ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３和ＦＲ４序列经任意组合而构成。文库所拥有的多样性组合储备，超过自然免疫系统，可用来表达新颖免疫球蛋白。文库可用于筛选具有感兴趣的靶标特异性的抗体。应用该文库所构建的抗体，是没有免疫原性的全人源化抗体。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及抗体文库之构建，该文库所具有的抗体储备多样性 (r印ertoirediversity)，超过自然免疫系统和现有的组合技术。该文库可用于筛选具有令人感兴趣的特异性的抗体，由此所构建的抗体被认为是功能性全人化抗体。 背景 单克隆抗体所具有的确切临床疗效和安全特性，使其成为代表性的专类治 疗药物。出现于70年代中期的杂交瘤技术突破，为医学界带来了疾病治疗特异 魔弹的希望。不过，直到一系列抗体技术出现，例如啮齿类抗体嵌合技术(参见 美国专利USP Nos. 4， 816， 567)和人源化技术(参见美国专利USP Nos. 5， 225， 539 ; 5， 585， 089 ;5， 693， 762 ;5， 693， 761)、噬菌体展示组合文库(Clackson et al. ， Nature, 352:624-628(1991) ;Felici et al. ， J Mol. Biol. ， 223 :301-310 (1991) ;Markland et al.Gene，109 :13-19 (1991))、转基因鼠(huMab/Xeno mouse)制备人化抗体技术(参见美国 专利USP Nos. 6， 075， 181 ;6， 150， 584 ;7， 041， 870)，以及抗体工业化制备技术，特异性魔 弹的希望才变成现实。抗CD20单抗——利妥昔(Rituximab)，开创了治疗性抗体时代的 先河。迄今，至少有19个治疗抗体获美国食品和药品管理局(FDA)批准上市，处在不同临 床试验阶段被评价的候选抗体多达数百个。 首先，抗体与对应靶抗原独一无二的位点结合，通过阻断靶细胞与配体的相互作 用(如ReoPro (abciximab) 、 Remicade (infliximab) 、 Humira (adalimumab)单抗等)，或者 通过介导免疫效应机制，清除肿瘤细胞(如Rituxan(rituximab、Herc印tin(trasuzumab)、 Campath-1 (alemtuz咖ab)单抗等)，从而发挥治疗功效。抗体的靶向特异性，也被用以 运载化学药物(如Myetotag (gemtuzumab))或方文身寸同位素(Zevaline (ibritumomab)、 Bexxar(tositumomab))，导向抵至耙细胞，而发挥对肿瘤细胞的毒性清除效应。治疗性抗体 以其独有的靶向特异性、经证明的临床疗效和安全性，为实现最佳的疾病诊断、治疗和其它 产业化应用，开辟了无限发展空间。 碰緣性 抗体的重要特征之一是其多样性，机体能够针对各种抗原耙点特异性，对应产生独一无二的抗体。这是通过抗体基因重组和体细胞突变过程才得以实现。 小鼠和人类负责编码免疫球蛋白的三个多基因家族，分别定位于不同的染色体(表l)。 表l.免疫球蛋白(Ig)基因的染色体定位3<table>table see original document page 4</column></row><table> 每一个基因家族所包含的编码序列称为基因片段。负责编码轻链的3个不同的基 因片段是可变区(V)基因片段(约300bp长)，连接区(J)基因片段(约50bp长)和恒定 区(C)基因片段(约300bp长)。以上所有的这些基因片段由长度不等的非编码DNA序列 分隔开来。胚系阶段如k-和A-轻链(也包括重链)基因片段都包含一DNA序列，它位 于V基因之前，负责编码一段长19个氨基酸的先导序列。轻链V基因片段负责编码第1-95 号氨基酸(含CDR1和CDR2) ;J基因片段负责编码第96 108号氨基酸(含CDR3) ， C基 因片段编码剩余部分的氨基酸(附图说明图1A)。人类k轻链大约有100个V基因片段，可与5个 J基因片段组合。正是由于如此众多的V-J基因连接位点才构成了抗体多样性的遗传学基 础(图2)。此外，在抗体的成熟过程中，可变区序列(由V-J基因重组连接而成)所发 生的体细胞突变导致抗体的亲和力和特异性进一步强化。大多数突变事件(缺失、添加和 序列替换)主要发生在CDR3基序中。人类A轻链基因家族大约由100个V基因和6个J 基因构成(图1A)。 A轻链的V-J基因在空间排列上与k链略有不同，其余则非常相似。 重链基因片段的组成与轻链相似，只不过重链基因包含有多样性(D)基因片段 (约50bp长)，而且每一个C基因片段都有一个或多个称为膜(M)外显子的关联编码片段。 和轻链一样，每一个重链V基因都有一个前导序列。负责编码重链的有4个不同基因片段 VH，DH，JH，CH。 VH基因片段编码第1 101号氨基酸(含CDR1和CDR2) ， DH基因片段编码 第102 106号氨基酸(CDR3之前)，JH基因片段编码第107 123号氨基酸，CH基因片 段编码其余氨基酸(图1B)。人类重链基因大约有100个功能性V基因，25-30个功能性D 基因，6个功能性J基因。由V-D-J基因重组而构成的重链可变区多样性与轻链类似，只不 过由于重链DH基因的存在和参与使得发生在CDR3基序的多样性数量远多于轻链(图2)。 抗体多样性产生于以下几个层面(a)胚系基因的可变性和V、D、 J基因片段的多 样性；(b)轻链V-J基因连接的自由组合、重链V-D-J基因连接的自由组合、重链与轻链的 组合匹配；(c)由于不精确的DNA重排、以及在D-J基因或V-D-J基因重组过程中随机插入 D-和J-基因之间的核苷，所导致的连接多样性；(d)体细胞高突变。 即使不考虑由体细胞高突变所增加的多样性，也可以推算出基因重组和连接所产 生的多样性的数量，如表2所示。 表2.抗体多样性基线计算 轻链基因片段4<table>table see original document page 5</column></row><table> <table>table see original document page 5</column></row><table> 此外，不同的组合连接也会增加基因的多样性基线。重链和轻链基因的组合就可 能编码出43 2 00X 1200 = 5. 1 X 107种可能的免疫球蛋白。因此，不考虑体细胞高突变率的 因素，估计人类免疫系统的抗体多样性为5. IXIO7。 抗体重塑技术 治疗性抗体在临床上的成功应用归因于抗体工程技术的突破，如嵌合技术和人源 化技术。凭借这些技术，可以将大多数的鼠源抗体转化成为人源化抗体且不显著改变亲本 抗体的特异性和与亲和力。 抗体嵌合技术(参见例如美国专利4， 816， 567)采用将鼠抗体重链和轻链可变区 移植到人抗体的恒定区的方法，因此嵌合抗体会含有约1/3鼠源成分序列。理论上，反复注 射这种抗体会对人体构成免疫原性。 传统的人源化抗体技术(参见例如美国专利5， 225， 539， 5, 585, 089,5， 693， 762， 5， 693， 761)通过将鼠源CDR移植到人源框架以达到降低鼠源成分比例的目的。人源本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于构建人免疫球蛋白噬菌体展示文库的方法，所述方法包括以下步骤：制备第一组核苷酸序列，所述序列编码人免疫球蛋白轻链可变区，其中所述第一组的序列包括人轻链ｃＤＮＡ片段的序列，负责编码ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３和ＦＲ４，其中所述片段经随机选择并连接，用以编码轻链可变区，所述轻链可变区按顺序包括ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ；制备第二组核苷酸序列，所述序列编码人免疫球蛋白重链可变区，其中所述第二组的序列包括人重链ｃＤＮＡ片段的序列，负责编码ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３和ＦＲ４，其中所述片段经随机选择并连接，用以编码重链可变区，所述重链可变区按顺序包括ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ；制备第三组核苷酸序列，所述序列编码免疫球蛋白单链Ｆｖ，其中所述第三组的序列包括所述第一组的轻链序列、连接体、和所述第二组的随机选择的重链序列，其中所述连接体将所述轻链序列和所述重链序列共价连接，构成第三组序列，用以编码免疫球蛋白单链Ｆｖ；以及将所述第三组核苷酸序列导入噬菌粒克隆载体，构建噬菌体展示文库。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-3-9 60/906,108用于构建人免疫球蛋白噬菌体展示文库的方法，所述方法包括以下步骤制备第一组核苷酸序列，所述序列编码人免疫球蛋白轻链可变区，其中所述第一组的序列包括人轻链cDNA片段的序列，负责编码FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4，其中所述片段经随机选择并连接，用以编码轻链可变区，所述轻链可变区按顺序包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR；制备第二组核苷酸序列，所述序列编码人免疫球蛋白重链可变区，其中所述第二组的序列包括人重链cDNA片段的序列，负责编码FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4，其中所述片段经随机选择并连接，用以编码重链可变区，所述重链可变区按顺序包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR；制备第三组核苷酸序列，所述序列编码免疫球蛋白单链Fv，其中所述第三组的序列包括所述第一组的轻链序列、连接体、和所述第二组的随机选择的重链序列，其中所述连接体将所述轻链序列和所述重链序列共价连接，构成第三组序列，用以编码免疫球蛋白单链...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁瑞安，黄佩芬，邝志威，陈业森，
申请(专利权)人：中国抗体制药有限公司，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]
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