双甲硫氨酸组蛋白制造技术

本发明专利技术提供了对包含作为第一和第二Ｎ末端氨基酸残基的经由肽键与成熟真核细胞组蛋白连接的两个甲硫氨酸残基的多肽进行编码的核酸分子。本发明专利技术此外还涉及包含所述核酸分子的载体、以所述载体转化的宿主、由所述核酸分子编码的多肽和药物组合物及诊断组合物。本发明专利技术还涉及本发明专利技术的核酸分子、载体、宿主和多肽在治疗疾病用组合物的制备中的应用。此外，本发明专利技术涉及检测所述核酸分子或多肽在样品中和对于试剂盒的存在的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了对包含作为第一和第二N末端氨基酸残基的经由肽键与成熟真核细胞组蛋白连接的两个甲硫氨酸残基的多肽进行编码的核酸 分子。本专利技术此外还涉及包含所述核酸分子的载体、以所述载体转化的 宿主、由所述核酸分子编码的多肽和药物组合物及诊断组合物。本专利技术 还涉及本专利技术的核酸分子、载体、宿主和多肽在治疗疾病用组合物的制 备中的应用。此外，本专利技术涉及检测所述核酸分子或多肽在样品中和对 于试剂盒的存在的方法。在整个说明书中引用了多种文献。在此通过参考整体引入包括制造 商手册的所述文献的公开内容。
技术介绍
目前，对如组蛋白等重组蛋白的高水平生产有着巨大的经济兴趣。 不仅对于为研究其性质和功能的研究提供足量的蛋白的目的，而且对于 为治疗应用供给大量蛋白的目的，大量重组蛋白的生产都令人感兴趣。对于重组蛋白的成功高水平生产和纯化已经考虑了大量的参数。重要参数包括表达条件、翻译调节和mRNA稳定性、蛋白靶向和降解 (Makrides, S., Microbiological Reviews, 1996: 512》为了改善重组蛋白的生产、检测和纯化， 一种方法是使用各种各样 的融合伴侣(Makrides, S., Microbiological Reviews, 1996: 512)。已经发展 出精细技术以便为纯化和检测重组蛋白而包含亲和标签。这类亲核标签 结合了允许更有效的纯化而同时也允许基于所述标签的对重组蛋白的轻 松检测的有利性质。然而，在许多情况下添加相当大的亲和标签可能由 于在蛋白翻译、折叠和活性上的不良效果而是不利的。尤其是用于治疗 应用时常常必须随后除去亲和标签，因而减弱了亲和标签赋予蛋白的一5些正效果(例如，容易检测)(Gellissen， G. Production of Recombinant Proteins, 2005, WILEY-VCH Verlag GmbH&Co KgaA, Weinheim)。在每条新生多肽的N末端的甲硫氨酸残基的加入构成了部分被原核 细胞和真核细胞使用的通用翻译起始信号。在大肠杆菌中，通过胞质酶 甲硫氨酸氨肽酶(map)可以实现将该N末端甲硫氨酸残基除去(Hirel等， Biochemistry, 1989， 86:8247)。据显示产生于原核细胞中(例如，大肠杆菌中)的重组真核细胞蛋 白的N末端甲硫氨酸残基的有效处理取决于与甲硫氨酸相邻的氨基酸。 尽管相互矛盾的数据显示对某些氨基酸似乎有这样的一致性对于小且 不带电荷的氨基酸残基Ala、 Gly、 Pro、 Ser、 Val、 Cys和Thr而言切割 的可能性最高。大的侧链似乎对甲硫氨酸处理不利(Hirel等，Biochemistry, 1989, 86:8247; Frottin等，Mol. & Cell. Proteomics, 2006， 12:2336; Gellissen, G. Production of Recombinant Proteins, 2005， WILEY-VCH Verlag GmbH&Co KgaA， Weinheim)。据认为N末端甲硫氨酸的处理不仅对蛋白稳定性起到重要作用 (Giglione等，EMBOJ., 2003, 1:13)而且对蛋白的正确功能也起着重要作 用，例如对于MEF-2C、人血红蛋白、白细胞介素-2、 RNA酶A同系物 或蛙核糖核酸酶所示(Meierhans和Allemann， J. Biol. Chem 1998, 273:26052; Adachi，K.等，Protein Expr. Purif.， 2000, 20:37; Endo, S.等， Biochemistry, 2001,40:914; Boix，E.等，J. Mol. Biol 1996, 257:992; Liao, Y.D.等，Nucleic Acids Res 2003, 31:5247; Varshavsky， A. ， Proc， Natl. Acad. Sci.， 1996, 93:12142)。至于为何大自然保留了如此专门的酶体系来除去甲 硫氨酸残基的额外理论是用于细胞甲硫氨酸池的回收以节约该必需氨基 酸(Hirel等，Biochemistry, 1989, 86:8247)。EP1254166描述了大肠杆菌中的组蛋白的重组生产。据认为这类人 类蛋白重组生产对治疗应用有利而且与人或小牛胸腺制剂相比更加有效 和节省成本。此外，蛋白的重组生产允许了生产过程中更好的品质控制。Pyo等(Pyo, S.H.等，Protein Expr. Purif.， 2001, l:38)描述了大肠杆菌 中重组组蛋白H1.5的生产，其中利用了组蛋白的强碱性性质以开发用于6大规模纯化重组蛋白的有效方法。尽管在现有技术中已经显示出高水平的重组蛋白生产，却仍迫切需 要找到检测所得重组蛋白的合适方法。如上所讨论，在本领域中广泛使 用了如组氨酸标签等亲和标签，但这可能对用于治疗用途的蛋白生产造 成问题。
技术实现思路
因此，本专利技术基本的技术问题是提供例如允许简化生产和检测的改 良重组真核细胞多肽。通过其特征描述于在权利要求的实施方式获得了对该技术问题的解 决方案。于是，本专利技术在第一实施方式中涉及一种核酸分子，所述核酸分子(a)编码多肽，所述多肽由(aa)和(ab)组成，(aa)作为第一和第二 N末端氨 基酸残基的经由肽键与(ab)相连的两个甲硫氨酸残基，(ab)成熟真核细胞 组蛋白；(b)编码多肽，所述多肽由(ba)和(bb)组成，(ba)作为第一和第二 N末端氨基酸残基的两个甲硫氨酸残基的多肽，所述甲硫氨酸残基经由 肽键与(bb)具有至少80%的与(^的成熟真核细胞组蛋白的序列一致性并 基本保留其生物活性的成熟真核细胞多肽相连；或(c)在严格条件下与编 码(a)或(b)的多肽的核酸分子的互补链杂交，其中所述核酸分子编码至少 具有上述两个N末端甲硫氨酸残基的多肽并基本保留(a)或(b)的多肽的生 物活性。根据本专利技术的核酸分子包括合成或半合成形式的DNA (如cDNA或 基因组DNA)和RNA (例如，mRNA)、 DNA或RNA的进一步合成或半 合成衍生物(例如PNA或硫代磷酸酯)以及混合聚合物，上述核酸分子 既可为正义链也可为反义链。本领域技术人员容易理解，它们可以包含 额外的非天然或衍生化核苷酸碱基。在一个优选实施方式中核酸分子为 DNA，包括基因组DNA。出于本专利技术的目的，肽核酸(PNA)是聚酰胺型DNA类似物，并且腺 嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的衍生物的单体单元可商购获得(Perceptive Biosystems)。如磷、磷氧化物或脱氧核糖衍生物等DNA的某 些成分在PNA中不存在。如Nielsen等，Science 254:1497 (1991);和 Egholm等，Nature 365:666 (1993)所公开，PNA与互补DNA链特异性且 紧密地结合并不被核酸酶降解。事实上，PNA比DNA自身更强力地与 DNA结合。这有可能是由于在两条链间没有静电排斥，而且聚酰胺主链 更有柔性。因此，PNA/DNA双链体比DNA/DNA双链体在更大范围的严 格条件下结合，使其易本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸分子，所述核酸分子　ａ）编码多肽，所述多肽由（ａａ）和（ａｂ）组成，　（ａａ）作为第一和第二Ｎ末端氨基酸残基的两个甲硫氨酸残基，所述甲硫氨酸残基经由肽键与（ａｂ）相连，　（ａｂ）成熟真核细胞组蛋白；　ｂ）编码多肽，所述多肽由 （ｂａ）和（ｂｂ）组成，　（ｂａ）作为第一和第二Ｎ末端氨基酸残基的两个甲硫氨酸残基，所述甲硫氨酸残基经由肽键与（ｂｂ）相连，　（ｂｂ）具有至少８０％的与（ａ）的成熟真核细胞组蛋白的序列一致性并基本保留其生物活性的成熟真核细胞多肽；或　 ｃ）在严格条件下与编码（ａ）或（ｂ）的多肽的核酸分子的互补链杂交，其中所述核酸分子编码至少具有上述两个Ｎ末端甲硫氨酸残基的多肽并基本保留（ａ）或（ｂ）的多肽的生物活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2007-4-5 07007200.4;EP 2007-9-26 07018956.81.一种核酸分子，所述核酸分子a)编码多肽，所述多肽由(aa)和(ab)组成，(aa)作为第一和第二N末端氨基酸残基的两个甲硫氨酸残基，所述甲硫氨酸残基经由肽键与(ab)相连，(ab)成熟真核细胞组蛋白；b)编码多肽，所述多肽由(ba)和(bb)组成，(ba)作为第一和第二N末端氨基酸残基的两个甲硫氨酸残基，所述甲硫氨酸残基经由肽键与(bb)相连，(bb)具有至少80％的与(a)的成熟真核细胞组蛋白的序列一致性并基本保留其生物活性的成熟真核细胞多肽；或c)在严格条件下与编码(a)或(b)的多肽的核酸分子的互补链杂交，其中所述核酸分子编码至少具有上述两个N末端甲硫氨酸残基的多肽并基本保留(a)或(b)的多肽的生物活性。2. 如权利要求1所述的核酸分子，其中，所述组蛋白选自由组蛋白 Hl.O、 Hl,l、 H1.2、 H1.3、 H1.4、 H1.5和Hit组成的组。3. —种与权利要求1或2所述的核酸分子互补的核酸分子。4. 一种如权利要求1或2所述的核酸分子的反义寡核苷酸或多核苷 酸，其中，所述寡核苷酸或多核苷酸包含与编码(aa)、 (bb)或(c)的上述两 个N末端甲硫氨酸残基的核苷酸三联体互补的核苷酸并具有10个核苷酸 的最小长度。5. —种包含权利要求1或2所述的核酸分子的载体。6. —种以权利要求5所述的载体转化的宿主，其中，所述宿主不是 人类并且不是人类胚胎。7. 如权利要求6所述的宿主，所述宿主为细菌、酵母菌细胞、昆虫 细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞或植物细胞。8. —种生成多肽的方法，所述方法包括在适当条件下培养权利要求 6或7所述的宿主并分离生成的多肽。9. 一种多肽，所述多肽由权利要求1或2所述的核酸分子编码或由 权利要求8所述的方法生成。10. —种组合物，所述组合物包含权利要求1或2所述的核酸分子、 权利要求5所述的载体、权利要求6或7所述的宿主或者权利要求9所 述的多...

【专利技术属性】
技术研发人员：米歇尔特里，彼得格罗斯，汉斯约恩瓦尔，格拉兹纳弗米卡兹佩扎乌尔，迈克尔兹佩扎乌尔，
申请(专利权)人：西姆拜奥泰克生物技术领域研究开发有限责任公司，米歇尔特里，
类型：发明
国别省市：DE[德国]