本发明专利技术涉及一种用于通过测定确定样品中的分析物的方法，所述测定可以一步形式进行而无需进行洗涤步骤。该方法包括第一分析物特异性受体和第二分析物特异性受体，其中所述第一分析物特异性受体含有至少一个分析物结合位点（例如颗粒上的多个抗体），所述第二分析物特异性受体能够选择性结合至少两个分析物分子的排列，所述至少两个分析物分子结合于第一受体。描述了夹心免疫测定，其中所述检测基于电化学发光。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测特异性免疫球蛋白G类抗体的方法
本专利技术涉及一种用于通过一步方式进行而无须洗涤步骤的测定确 定样品中的分析物的方法。作为对引入外来物质的应答，哺乳动物生物体的免疫系统产生抗 体，抗体又名免疫球蛋白。它们充当针对外来物质的防御，外来物质 也称为抗原。所述免疫球蛋白可以分为五种不同的类型。人们将免疫球蛋白区分为M、 G、 A、 E和D类。这五种免疫球蛋白类型的区别在 于重链的组成，所述重链分别称为p、 y、 a、 s和3链。每个免疫球蛋白类型在生物体中具有不同的功能。M类免疫球蛋 白在第一次与抗原接触(所谓的初次免疫)的过程中发生。然而，随着感 染的进行，这些免疫球蛋白的浓度快速降低。G类免疫球蛋白首先在初 次免疫的过程中緩慢地形成，并且在以同样的抗原进行第二次感染时 大量存在。A类免疫球蛋白在生物体粘膜表面被发现，负责局部防御过 程。E类免疫球蛋白主要负责过敏反应。迄今为止，D类免疫球蛋白的 精确功能仍是未知的。血液中各免疫球蛋白类型以非常不同的浓度存在。因此，G类免疫 球蛋白(IgG)是正常人血清中最丰富的类型，比例为约75 %,相当于 8-18 mg/ml的血清含量。第二最常见的免疫球蛋白是IgA,其平均血 清浓度为0.9- 4.5 mg/ml。 M类免疫球蛋白以0.6- 2.8 mg/ml的浓度存 在，D类免疫球蛋白以0.03-0.4 mg/ml的浓度存在。IgE抗体的比例是 最低的；它们仅以0.02-0.05|ag/ml的浓度存在于血清中。在现有技术中描述了多种用于检测针对抗原具有特异性的特定类 型的抗体的方法。因此，样品中特定类型的抗原特异性抗体的检测经 常通过将特异性抗体结合到包覆有所述特异性抗原的固相上进行。通 过将特异性地针对特定类型的人Ig的抗体结合到待检测的Ig分子上， 来检测对所述抗原具有特异性并且正结合于所述固相的免疫球蛋白 (Ig)。为针对人Ig的抗体^是供标记，通过该标记进4亍冲企测。然而，这 样的测试过程(间接测试形式)只有在如下情况下才是可能的如果在与 针对人Ig的类别特异性的标记抗体反应之前，通过洗涤除去所有非特 异性、未结合的Ig。因此， 一步测试方法，例如自动化系统经常需要5的方法，不可能是这种形式的。所谓的桥测试(bridge test)开启了在一 步测试中进行抗体检测的可 能性。在EP-A-0 280 211中描述了桥测试的概念。在这种方法中，将能 够特异性结合待测定抗体(例如抗原)的第一结合配偶体(partner)结合 于固相。待测定抗体则与结合于固相的抗原结合。另一种具有标记的 特异性抗原也存在于测试混合物中。通过该标记来^r测所述抗体。如 果不同类型但具有相同特异性的免疫球蛋白存在于样品中，则该测试 不能在不同类型之间进行区分。EP 0 944 838 Bl披露了 一种桥测试检测方法，该方法能够选择性 确定样品中的抗原特异性IgG抗体，该样品中也含有具有相同特异性的 IgM。为此，所述抗原以单体形式使用。所述单体抗原具有如下效果 具有相同特异性的IgM抗体不能与所述抗原反应或仅能与其微弱地反 应。特异性抗体测试在感染血清学中至关重要，在所述感染血清学中， 检烦'j 了针对病原体的抗原结构的免疫反应。虽然用于获得病原体的抗 原的不同来源是现有技术(原核和真核系统中的重组表达；病原体的控 制性培养，从天然来源分离抗原)，但并不总是可以获得单体形式的抗 原，从而以一步形式进行IgG-选择性免疫测定。EP 0 957 360 Bl描述了在用于测定分析物的方法中使用类风湿因 子来降低Hook效应。EP 1 098 198 Al描述了一种用于测定人IgG抗体的免疫测定。在该 案例中，使用了一种特殊的单克隆抗体，其针对结合于抗原的人IgG的 Fc片段的构象表位。该抗体用于选择性检测IgG,并且可以区分结合于 抗原的IgG和不结合抗原的IgG。然而，未结合的IgG的存在会干扰并 导致信号损失。EP 1 653 233 Al描述了 一种用于测定IgG类型的抗原特异性抗体的 测试方法，其中使样品与结合了抗原的固相接触。在该方法中，使用 单克隆抗体，该单克隆抗体区分未特异性结合于固相的免疫球蛋白和 结合于所述抗原的免疫球蛋白。使样品与固相接触后，将其洗去并随 后施加单克隆抗体。在专利申请WO 99/15898 (Chien等)中描述了 一种用于以一步形式 检测抗原特异性免疫球蛋白G的免疫测定，其可以使用自动分析仪进行。其中，使用了对人免疫球蛋白G的恒定部分具有特异性的抗体。 在该测定中，存在游离的非特异性IgG的显著干扰，没有充分区分游离的IgG与复合的IgG。因此，现有技术的用于检测IgG的一步法不能够充分区分游离的 IgG与结合的IgG。为了区分具有相同特异性的IgG和IgM，抗原必须 是单体的，而这是一个经常不能满足的要求。因此，本专利技术的目的在于开发一种用于检测样品中的分析物、特 别是G类免疫球蛋白的抗原特异性抗体的方法，该方法可以一步法进 行，从而其可以有利地用于自动化系统。此外，本专利技术的目的为至少 部分地克服现有技术的缺点。为此，有必要充分区分游离的分析物与 结合的分析物。第一方面，本专利技术涉及一种确定样品中的分析物的方法，该方法 包括以下步骤(a) 使样品与第一分析物特异性受体和第二分析物特异性受体接 触，其中两种受体之一结合于固相或能够结合于固相，而另一种受体 携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团，以及(b) 通过确定所述固相上产生信号的基团，检测所述分析物的存在或/和量，其特征在于第 一分析物特异性受体含有所述分析物的至少两个结 合位点，而第二分析物特异性受体能够选择性地结合于至少两个分析 物分子的排列，所述至少两个分析物分子结合于第一受体。意外地发现，样品中存在类风湿因子并不干扰本专利技术的方法。本专利技术的方法适于检测样品中的任何分析物。优选的是，所述分 析物是抗原特异性抗体，例如G、 M、 A、 D或/和E类的抗原特异性抗 体。更优选，所述分析物是G类抗原特异性抗体，例如针对病原体、 肿瘤抗原或/和自身抗原的G类抗原特异性抗体。 '含有分析物的样品优选为液体样品。所述液体样品可以是任何液 体样品，例如含水的样品。样品可以是生物样品或/和临床样品例如体 液如血液、血清、尿、唾液、脓等等。样品可以更优选含有类风湿因 子。在优选实施方式中，所述第一和第二分析物特异性受体彼此不同。在本专利技术的方法中，第二受体能够选择性结合至少两个分析物分 子的排列，所述至少两个分析物分子结合于第一受体。至少两个分析物分子的排列意为至少两个分析物分子一起具有如下结构第二受体可以选择性结合于该结构，即其可被第二受体识别，并且第二受体可 以将其与单一分析物分子、特别是未结合于第一受体的单一分析物分子区分开。能够选择性结合，，也表示与单一分析物分子相比，第二受 体可以更强地结合于至少两个分析物分子的排列。排列还可以是包含 结合于第一受体的至少两个分析物分子(特别是抗体)的免疫复合物。 第 一 受体可以包含具有至少两个表位的抗原。排列优选含有彼此聚集并结合于第一受体的至少两个分析物分 子。在本专利技术意义上，聚集的或聚集表示结合于所述受体的分析 物分子彼此处于某一距离，本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于确定样品中的分析物的方法，包括以下步骤： （ａ）使样品与第一分析物特异性受体和第二分析物特异性受体接触，其中两种受体之一结合于固相或能够结合于固相，而另一种受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团，以及 （ｂ）通过确 定所述固相上产生信号的基团检测所述分析物的存在或／和量， 其特征在于 所述第一分析物特异性受体含有所述分析物的至少两个结合位点，而所述第二分析物特异性受体能够选择性地结合于至少两个分析物分子的排列，所述至少两个分析物分子结合于所 述第一受体。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2007-5-8 07009240.81.用于确定样品中的分析物的方法，包括以下步骤(a)使样品与第一分析物特异性受体和第二分析物特异性受体接触，其中两种受体之一结合于固相或能够结合于固相，而另一种受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团，以及(b)通过确定所述固相上产生信号的基团检测所述分析物的存在或/和量，其特征在于所述第一分析物特异性受体含有所述分析物的至少两个结合位点，而所述第二分析物特异性受体能够选择性地结合于至少两个分析物分子的排列，所述至少两个分析物分子结合于所述第一受体。2. 权利要求1的方法，其特征在于所述分析物是抗原特异性抗体， 特别是免疫球蛋白G类抗原特异性抗体。3. 权利要求1或2的方法，其中所述第一受体结合于固相或能够结 合固相，而所述第二受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号 的基团。4. 权利要求1或2的方法，其中所述第二受体结合于固相或能够结 合固相，而所述第一受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团。5. 权利要求1至4任一项的方法，其中所述结合于第一受体的至少 两个分析物分子是聚集的。6. 权利要求1至5任一项的方法，其特征在于所述第一受体含有针 对所述分析物的至少两个不同的结合位点、至少两个相同的结合位点 或不同的和相同的结合位点的组合。7. 前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述第一受体是寡聚 化或多聚化受体。8. 前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述第一受体包含抗 原，所述抗原含有至少两个表位作为所述分析物的结合位点。9. 前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述第一受体包含珠。10. 前述权利要求任一项的方法，其中所述第一受体以受体前体的形式提供。11. 权利要求10的方法，其中所述受体前体具有这样的性质它 们可...
【专利技术属性】
技术研发人员：M布罗诺尔德，C马克特哈恩，F多尼，R博尔哈根，B乌普迈耶，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]
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