本发明专利技术涉及包含编码在强巨细胞病毒启动子控制下的完整或部分ｍｅｔａｒｇｉｄｉｎ的解联蛋白结构域（ＲＤＤ）或其衍生物的序列的ｐＯＲＴ质粒，特别地具有ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：２中显示的序列的质粒。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含编码metargidin的解联蛋白结构域(RDD)的序列的质粒本专利技术涉及包含编码在强巨细胞病毒启动子控制下的完整或部分metargidin的 解联蛋白(disintegrin)结构域(RDD)或其衍生物的序列的pORT质粒，特别地具有SEQ ID NO 2中显示的序列的质粒。所述质粒具有体内抗肿瘤活性，从而提供用于治疗癌症的有前 景的治疗剂。血管发生，新毛细血管从先前存在的血管的发生，是原发性实体瘤的生长和发展 所必需的。因此已提出了目的在于抑制此类肿瘤内新生血管形成(neovascularization) 的策略(Folkman，Nat Medl995 ；1 :27_31)。抗血管生成治疗对于限制癌症显示至少两个明 显的有利方面(a)应用于众多种癌症，因为血管发生对于所有恶性肿瘤来说是共同的现 象；和(b)肿瘤新生血管形成的限制和消退应当阻止肿瘤细胞进入循环，从而降低转移的 危险。adamalysin蛋白(也称为解联蛋白和金属蛋白酶蛋白(ADAMs))的家族包含位于 金属蛋白酶结构域上的解联蛋白结构域。解联蛋白区域包含与整联蛋白相互作用并且可介 导细胞-细胞相互作用的整联蛋白结合序列(Wolfsberg，J Cell Biol 1995;131:275-8)。 Metargidin (金属蛋白酶-RGD-解联蛋白蛋白)，也称为人ADAM-15，是由平滑肌细胞、肾小 球膜细胞以及由被激活的生成血管的内皮细胞(angiogenic endothelial cell)(以更高 的水平)表达的跨膜 adamalysin(KratZSChmar等人，J Biol Chem 1996 ；271 :4593_6 ； Ham 等人，Exp Cell Res 2002 ；279 :239_47 ；Herren 等人，FASEB J1997 ；11 173-80 ；Mart in 等人，J Biol Chem 2002 ；277 :33683_9)。AMEP (抗血管生成Metargidin肽)是metargidin的重组解联蛋白结构域(RDD)。 AMEP肽通过RGDC整联蛋白结合序列结合整联蛋白，例如α5β1和α ν β 3 (Zhang等人，J Biol Chem 1998 ;273 :7345_50 ;Nath等人，J Cell Sci 1999 ;112 :579_87)，这表明此类整 联蛋白和metargidin的功能可能是相互依赖的。表达为可溶性重组蛋白的AMEP可能阻止 该相互作用的假说导致探索RDD对血管发生和肿瘤生长的作用。之前证明RDD在体外抑制内皮细胞在毛细管样结构中的增殖、迁移、侵入和组织 化。在四环素诱导型系统中将被插入质粒的RDD cDNA电转移入小鼠骨骼肌。RDD产物在转 基因电转移入肌肉并且用多西环素(doxycycline)诱导后第14天，在体内抑制皮下(s. c.) 人乳腺MDA-MB-231肿瘤生长达78%。该抗肿瘤效应与显著减少的肿瘤血管形成相关。此 夕卜，在RDD存在的情况下，在1周的治疗后，在小鼠肺中，B16F10黑素瘤转移被抑制了 74% (Trochon-Joseph 等人，Cancer Res2004 ；64 :2062_2069)。然而，该四环素诱导型系统需要三种质粒(pBi-RDD质粒以及Tet-On和Tet_tTS 载体)的共转染和多西环素的联合施用。因此，考虑进一步发展更简单且有效的体内表达 RDD cDNA的方法。用包含驱动转基因的组成型表达的人巨细胞病毒(CMV)启动子和卡那霉素抗性 基因的PVAX质粒(Invitrogen，V260-20)进行了初步尝试。然而，该载体在转基因表达和 体外抗增殖活性方面未获得十分令人满意的结果。将RDD cDNA进一步克隆入由Cobra Biomanufacturing提供的用于人的临床应用 的缺乏任何抗生素抗性基因的质粒pORT-RDD质粒。该新型质粒的特征还在于强组成型 启动子(CMV-内含子A)、人分泌信号(人尿激酶uPA信号)、数目减少的免疫刺激性CpG序 列(在pORT-RDD中150个)、较小的大小和高拷贝数。意外地发现pORT-RDD载体在体外获 得与强抗增殖活性相关的高水平的RDD转基因的表达。已在体内进行了在黑素瘤的动物模 型中证明抗肿瘤和抗转移活性的进一步实验。因此，pORT-RDD载体提供了用于癌症和转移的抗血管生成治疗的有前景的治疗 剂。因为其缺乏任何抗生素抗性基因，因此根据涉及基因转移药品的临床方面的另外的指 导方针(Guideline EMEACPMP/BWP/3088/99 ；Directive 2001/18/CE)，该载体也是特别适 当的。定义“Metargidin”是指也称为MDC-15或ADAM-15的人金属蛋白酶-RGD-解联蛋白蛋 白。Kratzschmar等人(J Biol Chem 1996 ；271 :4593-6)描述了 metargidin 的克隆。“RDD”是指人metargidin的解联蛋白结构域。RDD的cDNA序列作为SEQ ID NO 1示于所附序列表中。“AMEP”或“抗血管生成Metargidin肽”是指重组RDD肽。术语“衍生物”是指其中从上述序列置换、添加或缺失1个或多个核苷酸的RDD的 cDNA序列的变体，只要其保持野生型RDD的生物活性，例如在体外和/或体内对内皮细胞增 殖的抑制和/或对血管发生的抑制。优选，这样的变体具有序列，所述序列与上述cDNA序 列SEQ IDN0 1具有至少80 %，优选至少85 %，至少90 %，更优选至少95 %，或至少98 %的 同一性。可以例如通过在不断增加的量的RDD的衍生物的片段存在的情况下或在其不存 在的情况下培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，进行例如96小时，以及通过进行细胞增殖测 定以定量细胞增殖的抑制来估量内皮细胞增殖的抑制。可通过本领域内技术人员已知的任 何适当的方法例如通过MTT测定法(例如细胞增殖试剂盒I，Roche Diagnostics, Germany) 来估量细胞增殖。血管发生的抑制可以例如通过测定小管样结构(由培养在支持基质例如基质胶 (Matrigel)上的内皮细胞形成)的形成来估量.术语“肽”无差别地指二肽、寡肽或多肽，即其中无论其长度，单体是通过酰胺键连 接在一起的氨基酸残基的聚合物。“质粒”是通常能够在它们的宿主例如细菌中自主复制的染色体外双链 DNA(dsDNA)分子。如本文中所使用的，术语“载体”和“质粒”无差别地指借助于其可将RDD cDNA序列导入宿主细胞以转化宿主并且促进RDD序列表达(例如转录和翻译)的媒介物。pORT质粒”是指包含易于被反式表达的阻抑物结合的操纵子的质粒。所述操纵 子可以是例如lac操纵子、A操纵子、trp操纵子、gal操纵子、ara操纵子、Arg操纵子和 Tet 操纵子。pORT 质粒已描述于 Williams 等人，Nucleic Acids Res. 1998 May 1 ；26 (9) 2120-4 ；Cranenburgh ^A, Nucleic Acids Res. 2001 Mar 1 ；29 (5) :E26本文档来自技高网...
【技术保护点】
包含编码在强巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子控制下的完整或部分ｍｅｔａｒｇｉｄｉｎ的解联蛋白结构域或其衍生物的序列的ｐＯＲＴ质粒，其中所述序列被插入。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2007-3-6 07290285.1;US 2007-3-6 60/893,189包含编码在强巨细胞病毒(CMV)启动子控制下的完整或部分metargidin的解联蛋白结构域或其衍生物的序列的pORT质粒，其中所述序列被插入。2.权利要求1的质粒，其包含编码序列SEQID NO 1的metargidin的解联蛋白结构 域或其变体的序列，在所述变体中一个或多个核苷酸被从SEQ ID NO :1置换、添加、缺失，所 述变体与SEQ IDN0 1具有至少80%的序列同一性并且保持在体外和/或体内抑制内皮细 胞增殖和/或抑制血管发生的能力。3.权利要求1或2的质粒，其包含编码metargidin的解联蛋白结构域(RDD)的序列， 其中所述质粒具有SEQ ID NO 2中显示的序列。4.用权利要求1至3的任一项的质粒转化的宿主细胞。5.权利要求4的宿主细胞，其为大肠杆菌。6.权利要求4的宿主细胞，其为哺乳动物细胞。7.产生pORT-RDD质粒的方法，其包括由培养权利要求4至6的任一项的宿主细胞，和 从培养的宿主细胞回收P0RT-RDD质粒组成的步骤。8.权利要求7的方法，其包括培养权利要求4或5的宿主细胞，并且其还包括通过下列 步骤纯化pORT-RDD质粒(a)碱性裂解培养的宿主细胞；(b)网袋过滤；(c)阴离子交换层 析；(d)浓缩；(e)离子对反相和尺寸排阻层析，和(f)过滤。9.从权利要求4或5的宿主细胞纯化pORT-RDD质粒的方法，该方法包括步骤(a)碱 性裂解宿主细胞；(b)网袋过滤；(c)阴离子交换层析；(d)浓缩；(e)离子对反相和尺寸排 阻层析，和(f)过滤。10.在哺乳动物细胞中体内或体外表达RDD肽的方法，该方法包括用pORT-RDD质粒转 化所述哺乳动物细胞，由此在哺乳动物细胞中表达RDD肽。11.权利要求10的方法，其中哺乳动物细胞是肿瘤细胞。12.包含权利要求1至3的任一项的质粒和药学上可接受的载体的药物组合物。13.权利要求1至3的任一项的质粒用于治疗肿瘤的用途。14.权利要求13的用途，其中所述质粒意欲用于预防和/或治疗转移性肿瘤。15.权利要求13或14的用途，其中将所述质粒与肿瘤或肌肉细胞接触并且如下电刺激 肿瘤或肌肉-首先，使用至少一个具有200至2000伏/cm的高电压(HV)场强的脉冲-其次，使用具有50至200伏/cm的低电压(LV)场强和300至2000ms的持续时间的...
【专利技术属性】
技术研发人员：C波奎特，S勒拜尔比内，
申请(专利权)人：生物联合制药公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]
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