从含紫杉醇物质生产紫杉醇的高产率提取方法技术

本发明专利技术涉及从含紫杉醇物质生产紫杉醇的分离方法，其步骤包括：从含紫杉醇物质制备丙酮混合液，再将丙酮混合液与水性溶剂接触，以形成水相上清液和沉淀。此沉淀的紫杉醇纯度高于紫杉醇提取物至少３倍。丙酮／水沉淀法以高产率制备高纯度紫杉醇，适合采用常规正相硅胶层析柱分离法进行工业规模的分离，以及药品级紫杉醇组合物的制品。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从含紫杉醇物质生产紫杉醇的工业化分离方法，以及一种药品级，高纯度紫杉醇组合物的制品。
技术介绍
紫杉醇(paclitaxel)为烷二帖类假生物碱，是近二十年来所发现的最重要的抗癌药。它存在于Taxaceae科植物，尤其见于红豆杉属的几种树和灌木。多数红豆杉烷类化合物均具有的细胞毒性，在治疗癌症上非常有用。其中又以紫杉醇经过最广泛的研究，也是首先得到批准，应用于临床治疗。从植物分离得来的天然物的药品方剂，有要求非常高的法规标准。包括生产方法的可靠度，产品纯度。尤其当原料含有其他结构和生物活性相似，具细胞毒性的化合物时更是这样。红豆杉的提取物一般均含有数种红豆杉烷类化合物，例如，浆果赤霉素III，cephalomannine，10-脱乙酰红豆杉醇(″10-DAT″)，10-脱乙酰浆果赤霉素III，7-epi-10-脱乙酰红豆杉醇(″7-epi-10-DAT″)，7-epi-paclitaxel和红豆杉醇-C。这些化合物和紫杉醇的分离，很难达到经济规模。供人类用的紫杉醇组合物的分离方法必需要能制备至少98.5％纯度紫杉醇，只含有微量红豆杉烷类化合物不纯物的。而且法规要求极低量的残留溶剂，例如，提取紫杉醇常用的甲醇，己烷，丙酮等。除了要在重现性和纯度符合法规要求之外，紫杉醇分离方法还要考虑简单，价廉等经济。紫杉醇在红豆杉属植物中的含量极少，因此，即使采用高紫杉醇含量的植物组织，例如T.brevifolia和T.yunnanensis的树皮(约0.02％)，或T.x media Hicksii灌木的针叶及根(0.005-0.15％)。仍然需要大量原料，来得到相对少量的紫杉醇。常规的提取和纯化紫杉醇的方法均缺乏效率，产率低。昂贵的材料、设备，使得以工业规模制备药品级紫杉醇的成本一向高昂。一般而言，依赖较廉价材料的方法，例如溶剂提取和正相硅胶层析法，都会导致低纯度，低产率，或两者都有。其他可能改善纯度，产率的方法不是不切实用，便是其工业化太过昂贵。大规模的操作需要一简单、价廉、可重现、高产率、高纯度、可靠的方法。但是高产率、高纯度经常是相背离的。在一多步骤的方法中，高产率有赖于每一中间步骤的高收率，但是以溶剂提取和分配法生产紫杉醇时，高收率的组份会含有大量结构相似的不纯物，必须再通过层析分离以得到高纯度。然则较廉价的层析介质，如硅胶(使用后即可弃，不必再生)，对于含少量紫杉醇的进料，并不具有高效的分离能力。因此，经常需要其他中间步骤来提高纯度，但是会以牺牲产率为代价。Huang等人描述过从8000磅以上的树皮大规模分离紫杉醇的方法。包括利用溶剂提取，微分(differential)结晶和正相硅胶层析法(Joumal ofNatural Products 49(4)665-669，1986)。该法展示了紫杉醇的一般溶解度和层析特性，也显示出以常规技术要得到高产率，高纯度产物的各种困难。之后的多数工艺，基本上都是Huang等人的方法的改进，以提高产率及/或纯度。但是，这些方法多数是实验室规模，难以放大成有效率的大规模生产。例如Nair在美国专利Nos.5,279,949和5,478,736(亦见于PCTPublication No.WO 97/09443)所描述的实验室级方法中，采用活性碳将70％乙醇/水提取物脱色，再以硅藻土初过滤，接着以乙酸乙酯提取脱色后的提取物，再蒸干得到红豆杉烷类化合物。将此红豆杉烷类化合物再溶于乙酸乙酯，上料于第一硅胶柱，以己烷/乙酸乙酯梯度洗脱。再继续以串联硅胶柱或者反相层析法纯化。可是Nair的方法不容易应用于工业规模的分离。原因之一是它需要大量的活性碳(约5％-15％重量/提取物体积)，将造成加工，清理和液流等困难。此外，活性碳和后续步骤均无法除去主要的不纯物，即使经过串联硅胶柱纯化，仍然难以分离。其结果是，经过三次正相硅胶层析法纯化得到的产品，纯度仍然不足以供药品级制备。必须再用HPLC或反相层析法纯化，无可避免的降低了产率，并且提高了成本。总之，Nair所描述的实验室级方法，在大规模化极不实际，而且昂贵。ElSohly等人的美国专利5,618,538和5,480,639提出许多实验室级分离紫杉醇，和其他红豆杉烷类化合物的实例，并评估植物品种，植物各部份，粗提取的溶剂系统，机械提取方法，分配分离的溶剂等。溶剂粗提物接着以硅藻土吸附，再分别用己烷/丙酮，甲醇/二氯甲烷和乙酸乙酯/二氯甲烷作洗脱剂，经三次正相硅胶层析法纯化。层析组份蒸干后，再行下一步骤，但是并未经过沉淀或结晶来提高纯度。从紫杉醇含量0.0074％的500公克曼地亚红豆杉中，可生产28毫克HPLC纯度的紫杉醇。因此，本方法的收率为约70％。虽然可得到高产率的紫杉醇，本方法仍然需要重复四次层析步骤，而且比其他方法使用更多的硅藻土，硅胶和溶剂也是其大规模化的明显障碍。Rao在美国专利5,380,916、5,475,120和5,670,673(亦见于WO92/07842)采用乙醇，氯仿，苯，甲醇等一系列溶剂提取，接着以反相层析法，实例为HPLC，用乙腈洗脱。但是，由于红豆杉植物提取物中含有许多干扰柱效和维修的杂质，反相层析法并不适合大规模制备紫杉醇。而且，反相层析法的介质非常昂贵，且不易再生，更新成本很高。用乙腈洗脱的大规模制备，必须用昂贵的容器，亦不切实际。Rao报告的产率约为0.05％紫杉醇，但是需要再加工才能达到药品级。原则上，只有能够以大规模生产高纯度紫杉醇的方法，才适用于工业化生产，因为方法的放大通常会对小试时所能达到的产品品质有负面影响。Hong等人在WO 96/34973的方法采用一种合成吸附剂，例如活性碳或黏土，以甲醇/二氯甲烷提取为初步处理，再以多重二氯甲烷冲洗及沉淀。首先以己烷得到23％紫杉醇沉淀，再经多重乙醇/水分级沉淀，产出85％紫杉醇沉淀供最后以HPLC纯化。Hong等人所描述的方法并不适合大规模制备。不仅因为活性碳有前述缺点，而且己烷，乙醇/水沉淀步骤已经被证实难以重现结果。此外，其多重沉淀步骤的每一步骤需时数天，大量溶剂和工业级的HPLC均缺乏效率，而且昂贵。应该注意的是，Hong等人在摘要中提到″超过90％的高收率″。但是经仔细检查，可以发现这只是最佳步骤的产率，总收率远低于此。Hong等人甚至曾报告产率达100％的步骤。在实验室经常可以通过大量辅助物质，昂贵、高效的技术(例如HPLC)，或费时费工的方法达到高收率。这些显然都是Hong等人所描述的方法的特点。因此，它可能适合实验室操作，但是其大规模生产的应用极为有限。Zamir在WO 98/07712所描述的方法，采用有机相提取。继以水洗，活性碳处理，再以非极性溶剂如甲苯，乙醚等，将红豆杉烷类化合物沉淀，重结晶。最后利用反相层析法或HPLC分离一系列的红豆杉烷类化合物，包括紫杉醇。此一方法有上述的诸多缺点，包括使用活性碳(需要多一道除去活性碳粉粒的清理步骤)，以及采用昂贵的反相层析法或HPLC。此外，该方法使用大量二氯甲烷及乙腈，也需要昂贵的容器。Liu和Yang在中国专利96102442.9所描述的方法的提取步骤，采用多孔高分子反相层析法。首先将乙醇提取物分配到二氯甲烷相，再经水洗，过滤，并立即上料到一多孔聚苯乙烯反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从紫杉醇提取物生产紫杉醇的分离方法，其步骤包括：将丙酮加入紫杉醇提取物以生成丙酮混合液；再将丙酮混合液与一种水性溶剂接触，以形成沉淀。此沉淀的紫杉醇纯度高于紫杉醇提取物至少３倍；以及回收该沉淀。

【技术特征摘要】
US 1998-12-30 09/223,6941.一种从紫杉醇提取物生产紫杉醇的分离方法，其步骤包括将丙酮加入紫杉醇提取物以生成丙酮混合液；再将丙酮混合液与一种水性溶剂接触，以形成沉淀。此沉淀的紫杉醇纯度高于紫杉醇提取物至少3倍；以及回收该沉淀。2.如权利要求1的方法，其中紫杉醇提取物含有至少5％重量紫杉醇，沉淀含有至少20％重量紫杉醇。3.如权利要求1的方法，其中紫杉醇提取物含有至少10％重量紫杉醇，沉淀含有至少40％重量紫杉醇。4.如权利要求1的方法，其中沉淀的紫杉醇纯度高于紫杉醇提取物至少4倍。5.如权利要求1的方法，其中紫杉醇提取物是包括各种含紫杉醇物质。6.如权利要求5的方法，其中含紫杉醇物质是包括各种红豆杉属的植物组织。7.如权利要求5的方法，其中含紫杉醇物质来源于一种细胞培养物，包括红豆杉属的植物组织细胞培养物。8.如权利要求7的方法，其中含紫杉醇物质是包括一种根细胞培养物。9.如权利要求7的方法，其中含紫杉醇物质是该细胞培养物的组织。10.如权利要求7的方法，其中含紫杉醇物质是细胞培养物的生长培养基。11.如权利要求6的方法，其中含紫杉醇物质是包括T.brevifolia，T.yunnanensis，T.x media dark green spreader，T.x media Hill，T.x mediaHicksii，T.cuspidata T.chinensis，T.wallichiana，T.canadensis，T.globosa和T.sumatrana或其混合物的植物组织。12.如权利要求11的方法，其中植物组织包括树皮，树种包括T.brevifolia或T.yunnanensis。13.如权利要求11的方法，其中植物组织包括根，树种包括T.xmedia dark green spreader，T.x media Hill，T.x media Hicksii或T.cuspidata。14.如权利要求11的方法，其中植物组织包括针叶，树种包括T.xmedia dark green spreader，T.x media Hill，T.x media Hicksii，T.cuspidata或T.canadensis。15.如权利要求5的方法，其中含紫杉醇物质是一种生产紫杉醇的微生物。16.如权利要求15的方法，其中该微生物是一种Erwinia taxi或Taxomyces andreanae。17.如权利要求1的方法，其中紫杉醇提取物是进行至少一次的层析\洗脱紫杉醇而制得。18.如权利要求17的方法，其中层析介质为硅胶基质。19.如权利要求1的方法，其中紫杉醇提取物来自将含有一种有机溶剂的紫杉醇混合液进行至少两次的沉淀。20.如权利要求1的方法，其中紫杉醇提取物是进行至少一次的层析，洗脱紫杉醇，以及将溶于一种有机溶剂的紫杉醇混合液进行至少一次的沉淀来制备。21.如权利要求17-20的任何一项的方法，其中紫杉醇提取物是进一步进行至少一次有机溶剂的液液萃取，以形成两相溶液，其中一相富含紫杉醇。22.如权利要求1的方法，其中水性溶剂含有至少50％体积的水。23.如权利要求1的方法，其中水性溶剂含有至少70％体积的水。24.如权利要求1的方法，其中水性溶剂含有至少90％体积的水。25.如权利要求1的方法，其中水性溶剂含有纯水。26.如权利要求22-25的任何一项的方法，其中水性溶剂为缓冲液。27.如权利要求1的方法，其中以1-5体积水性溶剂加入1体积的丙酮混合液。28.如权利要求1的方法，其中以2-3体积水性溶剂加入1体积的丙酮混合液。29.如权利要求1的方法，其中以2.5体积水性溶剂加入1体积的丙酮混合液。30.如权利要求1的方法，其中沉淀所包含的不纯物量低于丙酮混合液的不纯物含量。31.如权利要求30的方法，其中沉淀所包含的不纯物量低于丙酮混合液的不纯物含量的至少50％。32.如权利要求30的方法，其中沉淀所包含的不纯物量低于丙酮混合液的不纯物含量的至少75％。33.如权利要求1的方法，其中沉淀包含至少90％的存在于丙酮混合液的紫杉醇。34.如权利要求1的方法，其中沉淀包含至少95％的存在于丙酮混合液的紫杉醇。35.一种制备至少5％重量紫杉醇的丙酮混合液的方法，其步骤包括a)以甲醇提取含至少0.005％紫杉醇的紫杉醇物质，以制备甲醇提取物；b)将甲醇提取物与二氯甲烷、水进行液液萃取，分离成两相，甲醇相包含水/甲醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡祥海，白玉里，马丁艾略特，
申请(专利权)人：加拿大植原药物公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]