【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及转基因，特别是涉及一种基于crispr/cas9构建mir-181a-2敲除小鼠动物模型的方法及其应用。
技术介绍
1、基因编辑技术是通过核酸内切酶对基因组dna进行定向改造的技术，可以实现对特定dna碱基的缺失、替换等。目前，常用的三种基因编辑工具分别是：锌指核酸酶(zincfinger nucleases，zfns)、类转录样效应因子核酸酶(transcriptionactivator-like effectornucleases，talens)以及crispr/cas9系统，其中crispr/cas9作为一种新型的基因组编辑技术，具有简单、特异性好、切割效率高的优点。crispr/cas9技术在多种生物体内得到了应用，成功获得了多种基因修饰后的生物。目前，crispr/cas9技术形成了仅需sgrna和cas9蛋白共同作用即可实现对目的序列编辑的工程化系统。目前，crispr/cas9技术被广泛应用于肿瘤学研究领域，针对肿瘤发展过程中的关键基因，通过直接受精卵注射cas9蛋白和sgrna制备基因编辑动物模型，用于相关疾病发病机制研究，为生物医学研究领域提供更多新的模型资源。该技术已被用于构建多种小鼠基因敲除模型，为研究特定基因的功能和疾病机理提供了重要工具。
2、mirna是一类长度在18-25个核苷酸的内源性单链小分子非编码rna，广泛存在于真核生物细胞内，具有重要的基因调节作用。近年来，mirna的功能已成为肿瘤学研究重点，其在不同类型肿瘤中差异性表达，并直接参与调控肿瘤细胞的周期、分化、凋亡
3、鉴于mir-181a-5p在多种肿瘤发展进程中发挥关键作用，进一步研究mir-181a-5p的功能与作用对于阐明肿瘤的发病机制具有重要意义。如何快速准确的构建mir-181a-5p敲除小鼠动物模型，以促进相关疾病的研究，是目前急需解决的问题。
4、crispr/cas9技术存在以下风险：①脱靶效应，即cas9酶可能切割非目标dna序列，导致非预期的基因突变；②protospaceradjacent motif(pam)序列限制；③马赛克现象；④基因组不稳定性；⑤纯合致死，理论上，大约有1/3的基因纯合敲除后会导致小鼠胚胎期死亡或出生期死亡。前期研究结果表明，mir-181a全身性敲除小鼠存活率显著降低。这意味着mir-181a-1/2全身性敲除可能会出现纯合致死现象。因此，亟需在制备mir-181a敲除小鼠动物模型时，考虑这种潜在的风险，采取相应的措施来避免或减少这种致死现象的发生。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种基于crispr/cas9构建mir-181a-2敲除小鼠动物模型的方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术提供了特异性靶向非编码基因mir-181a-2的两条sgrna，利用cas9蛋白对mir-181a-2进行双向敲除，获得了稳定繁殖的mir-181a-2敲除小鼠动物模型。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供了一种用于敲除小鼠mir-181a-2的sgrna，所述sgrna由核苷酸序列如seq id no.2所示的sgrna1和核苷酸序列如seq id no.5所示的sgrna4组成。
4、本专利技术还提供了一种所述的sgrna在制备敲除小鼠mir-181a-2的产品中的应用。
5、优选的是，所述产品为试剂盒。
6、本专利技术还提供了一种敲除小鼠mir-181a-2的试剂盒，包括所述的sgrna。
7、本专利技术还提供了一种构建mir-181a-2敲除小鼠动物模型的方法，包括使用所述的sgrna或所述的试剂盒进行基因敲除的步骤。
8、优选的是，包括以下步骤：
9、将所述的sgrna与cas9 mrna制备显微注射液，采集受精卵后进行显微注射，获得注射后存活受精卵，移植所述注射后存活受精卵至代孕母鼠，获得仔鼠，鉴定基因型，获得f0代阳性小鼠；
10、将所述f0代阳性小鼠与野生型背景鼠交配，获得f1代小鼠，鉴定基因型，获得f1代杂合小鼠；
11、将所述f1代杂合小鼠中的雄鼠和雌鼠交配，获得f2代小鼠，鉴定基因型，获得f2代纯合小鼠，即得所述mir-181a-2敲除小鼠动物模型。
12、优选的是，所述显微注射液中，所述sgrna与所述cas9 mrna的质量比为1:2。
13、优选的是，所述鉴定基因型包括使用核苷酸序列如seq id no.11-12所示的引物进行pcr反应和对所述pcr反应的产物进行琼脂糖凝胶电泳的步骤。
14、本专利技术还提供了一种根据所述的方法获得的mir-181a-2敲除小鼠动物模型在研制抗肿瘤药物中的应用。
15、优选的是，所述肿瘤为口腔癌。
16、本专利技术公开了以下技术效果：
17、本专利技术利用crispr/cas9技术设计特异性靶向非编码基因mir-181a-2的两条sgrna，结合cas9蛋白进行双向敲除，可获得稳定繁殖的mir-181a-2敲除小鼠品系，提供了一种精确、高效且简单易行的方法，成功避免mir-181a-1/2同时敲除导致的纯合致死风险，便于研究人员快速实施和重复实验。本专利技术为探究mir-181a的功能提供了重要工具，有助于推动mir-181a在相关疾病机制研究和治疗策略方面的应用，同时减少实验动物的使用，降本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于敲除小鼠miR-181a-2的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA由核苷酸序列如SEQID NO.2所示的sgRNA1和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的sgRNA4组成。
2.一种如权利要求1所述的sgRNA在制备敲除小鼠miR-181a-2的产品中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒。
4.一种敲除小鼠miR-181a-2的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的sgRNA。
5.一种构建miR-181a-2敲除小鼠动物模型的方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的sgRNA或权利要求4所述的试剂盒进行基因敲除的步骤。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述显微注射液中，所述sgRNA与所述Cas9mRNA的质量比为1:2。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述鉴定基因型包括使用核苷酸序列如SEQID NO.11-12所示的引物进行PCR反应和对所述PCR反应的产物进行琼脂
9.一种根据权利要求5-8任一项所述的方法获得的miR-181a-2敲除小鼠动物模型在研制抗肿瘤药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为口腔癌。
...【技术特征摘要】
1.一种用于敲除小鼠mir-181a-2的sgrna，其特征在于，所述sgrna由核苷酸序列如seqid no.2所示的sgrna1和核苷酸序列如seq id no.5所示的sgrna4组成。
2.一种如权利要求1所述的sgrna在制备敲除小鼠mir-181a-2的产品中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒。
4.一种敲除小鼠mir-181a-2的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的sgrna。
5.一种构建mir-181a-2敲除小鼠动物模型的方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的sgrna或权利要求4所述的试剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋国华，吴学海，王恬，杨钧婷，王晓堂，闫晓如，马云辉，高继萍，宋晓娜，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：
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