【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及β-内酰胺酶耐药基因的检测领域，尤其涉及一种β-内酰胺酶耐药基因的检测方法。
技术介绍
1、在现代畜牧业中，牛作为重要的经济动物，为人类提供了丰富的奶制品和肉制品。然而，牛在养殖过程中常常会受到各种病原菌的感染，其中大肠杆菌是引起牛发病的常见病原菌之一。β-内酰胺类抗生素是一类广泛应用于兽医临床和人类医疗的重要抗菌药物，具有抗菌谱广、活性强、毒性低等优点。在牛的养殖过程中，为了预防和治疗大肠杆菌等病原菌引起的疾病，β-内酰胺类抗生素被大量使用。随着抗生素的广泛使用，细菌的耐药性问题也日益严重。大肠杆菌作为一种常见的病原菌，其对β-内酰胺类抗生素的耐药性也在不断增强。质粒介导的β-内酰胺酶是大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的重要机制之一。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，各种新型的检测技术不断涌现，为牛源大肠杆菌质粒介导β-内酰胺酶耐药基因的检测提供了更加准确、快速的方法。发表于《公共科学图书馆-全球公共卫生》的分析显示，尽管人们在努力减少抗生素的使用，然而，预计2020年至2030年期间，全球畜牧业的抗生素使用量仍将增8％据研究人员估计，预计到2030年,全球畜牧业每年使用抗生素量将达10.75万吨，而2020年这一数字低于10万吨。由于肉制品需求的增加，非洲抗生素使用量增长最快，2020年至2030年间将增长25％。
2、大肠杆菌是引起牛感染性疾病的重要病原菌之一，而β-内酰胺类药物作为临床上广泛使用的抗菌药物，其耐药问题日益严重。了解牛源大肠杆菌对β-内酰胺类药物的耐药性，对于有效防治牛病
3、为了应对细菌耐药性问题，国外在牛源大肠杆菌耐药性防控方面进行了大量研究。一方面，加强抗生素的合理使用管理，制定严格的抗生素使用规范，减少不必要的抗生素使用。另一方面，探索开发新型抗菌药物和替代疗法，如噬菌体疗法、益生菌疗法等。
4、牛源大肠杆菌是引起牛群疾病的重要病原菌，近年来其耐药性问题日益严重。在畜牧业中，抗生素常被用作生长促进剂和预防疾病，这种长期低剂量的使用增加了耐药菌的出现和传播风险。这些耐药菌不仅威胁到动物健康，还可能通过食物链传播给人类，成为公共卫生的重大隐患。本研究聚焦于微生物学和分子生物学领域，特别是抗生素耐药性基因的检测与分析。抗生素的使用在我国因为不同地区的差异，其使用情况各有所不同，分离的大肠杆菌耐药性具有地域性、多样性。
5、通过对广西右江、玉林地区牛源大肠杆菌中质粒介导的β-内酰胺酶耐药基因的研究，旨在揭示这些基因的分布、传播机制及其对公共健康的潜在影响。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种β-内酰胺酶耐药基因的检测方法。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采取了如下技术方案：
3、本专利技术公开了一种β-内酰胺酶耐药基因的检测方法，包括如下步骤：
4、步骤1：细菌质粒的提取
5、步骤2：引物的设计与合成
6、从genbank中下载tem-1与ampc的序列，利用megalign对核苷酸序列进行比较，找到基因保守区域，利用primer explore v5设计引物；
7、步骤3：pcr扩增
8、以提取的细菌全基因dna和细菌质粒dna为模板，加入pcr反应体系各反应物，并按照对应扩增物所需的反应温度进行pcr扩增。
9、优选的，所述步骤1中，具体方法如下：
10、取1.0～5.0ml过夜培养的菌液，室温下10,000xg离心1min收集细菌，弃除上清培养基，加入250μl solutioni/rnasea混合液，漩涡振荡使细菌完全分散，往重悬液中加入250μl solutionl，轻轻颠倒数次混匀，加入350μlsolutionⅲ，温和颠倒数次至形成白色絮狀沉淀，室温下13,000xg离心10min；把dna mini column套至2ml离心管中，转移700μl上清液至dnamini column，室温下最大速度离心1min，弃除滤液；把dna mini column重新装回收集管，加入500μl hbc buffe7已加异丙醇正确稀释，室温下最大速度离心1min，弃除滤液；将dna mini column重新放入收集管中，加入700μldna洗涤缓冲液，在室温下以最高速度离心1分钟，丢弃滤液，弃去滤液；把dnaminicolumn重新装回收集管，最大速度离心空柱2min以甩干结合柱基质；把dna minicolumn装在干净的1.5ml离心管上，加入30-100μl elution buffer到结合柱基质中，静置1min，13,000xg离心1min洗脱出dna；提取成功后放置-20℃冰箱保存。
11、优选的，所述步骤2中，引物信息如表1所示：
12、表1耐药基因引物序列信息
13、
14、
15、优选的，所述步骤3中，tem-1和ampc基因的pcr均按照以下反应体系进行扩增，如表2所示：
16、表2pcr反应体系(25μl)
17、
18、优选的，所述步骤3中，pcr扩增产物用每100ml含3μl goldview的1％琼脂糖凝胶中进行电泳30min，电压为120v。
19、本专利技术相对于现有技术取得了以下技术效果：
20、本次实验通过对牛源大肠杆菌作质粒介导β-内酰胺耐药性检测和分析发现，对于全基因组的tem-1型、ampc型基因的耐药检出率，右江为76％和95％(n＝38)；玉林为98％和89％(n＝44)，而质粒dna的耐药检出率均为100％。研究结果为进一步防控牛源细菌感染性疾病以及合理使用抗菌药物提供了科学依据，同时也为指导畜牧场用药和兽医临床的科学用药提供了有价值的数据支持和理论参考。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种β-内酰胺酶耐药基因的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种β-内酰胺酶耐药基因的检测方法，其特征在于，所述步骤1中，具体方法如下：
3.根据权利要求1所述的一种β-内酰胺酶耐药基因的检测方法，其特征在于，所述步骤2中，引物信息如表1所示：
4.根据权利要求1所述的一种β-内酰胺酶耐药基因的检测方法，其特征在于，所述步骤3中，TEM-1和ampC基因的PCR均按照以下反应体系进行扩增，如表2所示：
5.根据权利要求1所述的一种β-内酰胺酶耐药基因的检测方法，其特征在于，所述步骤3中，PCR扩增产物用每100mL含3μL goldview的1％琼脂糖凝胶中进行电泳30min，电压为120V。
【技术特征摘要】
1.一种β-内酰胺酶耐药基因的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种β-内酰胺酶耐药基因的检测方法，其特征在于，所述步骤1中，具体方法如下：
3.根据权利要求1所述的一种β-内酰胺酶耐药基因的检测方法，其特征在于，所述步骤2中，引物信息如表1所示：
4.根据权利要求1所述的一...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘艳，覃振斌，王小玲，谢江，李凤梅，董覃婷，谢飞，覃梓轩，农彩璇，
申请(专利权)人：广西农业职业技术大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。