本发明专利技术公开了Bst DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用。本发明专利技术将野生型聚合酶大片段Bst‑LF进行了单位点或双位点突变获得了系列的单位点或双位点突变体，相比于野生型Bst DNA聚合酶，所获得的单位点或双位点突变体的酶活性均有显著提升；其中，双位点突变体Bst‑LF‑P236S‑M455L应用于LAMP扩增反应中能够检测到5×10<supgt;3</supgt; copies/mL的质粒模板，灵敏度高于野生型Bst DNA聚合酶以及商品化酶；应用于RT‑LAMP扩增反应时，其灵敏度也较野生型Bst DNA聚合酶以及商品化酶均有所提高，所用模板浓度为1×10<supgt;‑5</supgt; ng/μL时，仍能扩增出条带。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及dna聚合酶突变体，尤其涉及bst dna聚合酶突变体及其制备方法和应用，属于dna聚合酶突变体及其应用领域。
技术介绍
1、bst dna聚合酶来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌(
geobacillus stearothermophilus,bst)，其被枯草杆菌蛋白酶水解后的大片段（bst large fragment，bst-lf），因同时具有5′-3′dna聚合酶活性和强大的链置换活性，已被广泛应用于各种等温扩增反应中，尤其在环介导等温扩增反应中（loopmediatedisothermal amplification，lamp），bst-lf是最主流的聚合酶。
2、lamp技术由日本科学家notomi于2000年首次提出，该技术利用多对特异性引物在具有链置换活性的dna聚合酶作用下，实现在单一温度下对目的片段的大量扩增，该方法操作简单、成本低廉、设备要求低（仅需恒温条件），能够在不到1小时内快速出结果，广泛应用于临床场景下的病原学快速检测和筛查，尤其适用于养殖场内的动物疫病防控，不但能够节约人力、检测成本，而且检测时间灵活，缩短了疾病确诊的时间周期，前置了养殖场响应疫情的时间窗口期，为疫病防控奠定良好基础。
3、更快速、更灵敏的lamp检测将进一步助力临床疫病早发现、少漏检，也是近年来随着lamp技术推广与使用过程中形成的发展趋势和要求，研制出高酶活以及高灵敏度的bstdna聚合酶对于lamp技术推广与使用是关键之一。
>技术实现思路1、本专利技术的目的之一是提供bst dna聚合酶的突变体。
2、本专利技术的目的之二是提供所述的bst dna聚合酶的突变体的编码基因。
3、本专利技术的目的之三是提供含有所述的突变体的编码基因的重组表达载体或含有所述重组表达载体的重组宿主细胞。
4、本专利技术的目的之四是将所述的bst dna聚合酶的突变体作为dna聚合酶应用于dna或rna的lamp扩增反应。
5、为了实现上述目的，本专利技术所采用的主要技术方案包括：
6、本专利技术一方面是提供了bst dna聚合酶的突变体。
7、本专利技术中所述野生型bst dna聚合酶大片段为来自嗜热脂肪地芽孢杆菌（
geobacillus stearothermophilus）的dna聚合酶；所述野生型bst dna聚合酶大片段在ncbi上氨基酸序列号为pdb: 1l3s_a。
8、本专利技术的一种优选的具体实施方案，所述的单位点突变体是将seq id no.1所示的bst dna聚合酶的氨基酸序列按照d176g、p236s、m455l或p500s中任何一种单位点突变所获得的单位点突变体。
9、本专利技术中所述的单位点突变体“bst-lf-p500s”表示将氨基酸序列为seq id no.1所示的bst dna聚合酶的第500位氨基酸由脯氨酸（p）突变成丝氨酸（s）；本专利技术其余的单位点突变体的表述依此类推。
10、本专利技术的一种优选的具体实施方案，所述的双位点突变体是将seq id no.1所示的bst dna聚合酶的氨基酸序列按照d176g-p500s、p236s-p500s、m455l-p500s中的任何一种双位点突变获得的双位点突变体。
11、本专利技术中所述的双位点突变体“bst-lf-d176g-p500s”表示同时将氨基酸序列为seq id no.1所示的bst dna聚合酶的第176位氨基酸由天冬氨酸（d）突变成甘氨酸（g）以及第500位氨基酸由脯氨酸（p）突变成丝氨酸（s）；本专利技术其余的双位点突变体的表述依此类推。
12、本专利技术另一方面是提供了所述的bst dna聚合酶的突变体的编码基因。
13、本专利技术的另一方面是提供含有所述的突变体的编码基因的重组表达载体或含有所述重组表达载体的重组宿主细胞。
14、本专利技术的一种优选的具体实施方案，所述的表达载体包括原核表达载体或真核表达载体；其中，所述的真核表达载体为家蚕杆状病毒表达载体。
15、本专利技术的一种优选的具体实施方案，所述的宿主细胞包括昆虫活体或昆虫细胞系；其中，所述的昆虫细胞系为家蚕bmn细胞。
16、本专利技术进一步提供了制备所述的突变体的制备方法，包括：（1）构建含有所述的单位点突变体或双位点突变体的编码基因的表达载体；（2）将所构建的表达载体转化宿主细胞，在宿主细胞中表达蛋白，纯化，即得。
17、本专利技术的另一方面是将所述的bst dna聚合酶的突变体作为dna聚合酶应用于dna或rna的lamp扩增反应。
18、本专利技术将野生型聚合酶bst-lf进行了单位点或双位点突变，获得了系列的单位点或双位点突变体；相比于野生型bst dna聚合酶，单位点或双位点突变体的酶活性均有显著提升。其中，双位点突变体bst-lf-p236s-m455l应用于lamp扩增反应中能够检测到5×103copies/ml的质粒模板，灵敏度高于野生型bst dna聚合酶以及商品化酶；应用于rt-lamp扩增反应时，其灵敏度较野生型bst dna聚合酶以及商品化酶均有所提高，所用模板浓度为1×10-5ng/μl时，仍能扩增出条带。
19、本专利技术所涉及到的术语定义
20、除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
21、术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。
22、术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本专利技术多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
23、术语“转化”指将编码基因导入到宿主细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到宿主细胞中。
24、术语“表达”：内源性基因或转基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。
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【技术保护点】
1.Bst DNA聚合酶的单位点突变体，其特征在于，所述的单位点突变体是将SEQ IDNO.1所示的Bst DNA聚合酶的氨基酸序列按照D176G、P236S、M455L或P500S中任何一种单位点突变所获得的单位点突变体。
2.Bst DNA聚合酶的双位点突变体，其特征在于，所述的双位点突变体是将SEQ IDNO.1所示的Bst DNA聚合酶的氨基酸序列按照D176G-P500S、P236S-P500S或M455L-P500S中的任何一种双位点突变所获得的双位点突变体。
3.权利要求1所述的单位点突变体或权利要求2所述的双位点突变体的编码基因。
4.含有权利要求3所述的编码基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为家蚕杆状病毒表达载体。
6.含有权利要求4所述的表达载体的重组宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为重组昆虫细胞。
8.权利要求1所述的单位点突变体或权利要求2所述的双位点突变体的制备方法，其特征在于，包括：（1）构建含有所述的单位点突变体或双位点突变体的编码基因的表达载体；（2）将所构建的表达载体转化宿主细胞，在宿主细胞中表达蛋白，纯化即得。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的表达载体为家蚕杆状病毒表达载体；
10.权利要求1所述的单位点突变体或权利要求2所述的双位点突变体突变体作为DNA聚合酶在DNA或RNA的LAMP扩增反应中的应用。
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【技术特征摘要】
1.bst dna聚合酶的单位点突变体，其特征在于，所述的单位点突变体是将seq idno.1所示的bst dna聚合酶的氨基酸序列按照d176g、p236s、m455l或p500s中任何一种单位点突变所获得的单位点突变体。
2.bst dna聚合酶的双位点突变体，其特征在于，所述的双位点突变体是将seq idno.1所示的bst dna聚合酶的氨基酸序列按照d176g-p500s、p236s-p500s或m455l-p500s中的任何一种双位点突变所获得的双位点突变体。
3.权利要求1所述的单位点突变体或权利要求2所述的双位点突变体的编码基因。
4.含有权利要求3所述的编码基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：高新桃，刘兴健，吴彤，周诚昊，张文荣，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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