【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及模式动物疾病模型的构建方法，尤其涉及用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法。
技术介绍
1、新生儿先天性十二指肠梗阻是一种由于胎儿期十二指肠发育异常导致的肠腔阻塞性疾病，是新生儿消化道梗阻中较常见的一种类型。其全球发病率约为 1/5000 至 1/10000 新生儿，在亚洲人群中更为常见。该病的典型临床表现包括出生后即出现呕吐、上腹部膨隆以及胎便排出延迟。
2、十二指肠梗阻的病因尚未完全明确，目前主要的病理机制假说包括胚胎发育过程中肠管再通异常（通常发生在孕 5–7 周）和肠系膜动脉血供障碍。多数病例呈散发性，但部分患者可能具有遗传易感性。近年来，基因研究表明，jag1、gata4 和 fgf10 等基因可能在十二指肠发育过程中发挥重要作用。
3、 snapc4基因位于人类第 15号染色体，编码小核糖核蛋白体活化蛋白复合体4号亚单位(small nuclear rna activating protein complex 4)。这一蛋白在 rna 聚合酶ⅱ和iii的转录过程中起到关键作用,尤其是在小核 rna 的转录激活中发挥重要角色。近年来，针对 snapc4基因的研究显示，其变异与多种疾病相关。2023年，altamimi 等人在由一对近亲结婚的夫妻生下的2个新生儿胆道闭锁患儿中发现在 snapc4基因纯合突变强调了其可能在新生儿胆道闭锁中的作用。 snapc4的功能和表
4、本研究利用crispr/cas9系统构建 snapc4斑马鱼系，通过对突变体消化道畸形的结构和病理分析描述突变鱼系的发病情况。
5、 临床特征 患者信息 性别 男 消化道畸形表型 十二指肠梗阻 其他疾病 先天性回盲部异位、新生儿胃出血、头皮水肿、动脉导管未闭、新生儿高胆红素血症、新生儿贫血 家庭成员发病 无 相关基因 snapc4 核苷酸改变 nm_003086:c.a1354gnm_003086:c.a1021g 氨基酸改变 p.k452e、p.n341d 基因型 复合杂合 遗传来源 母亲/父亲
技术实现思路
1、用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法，其特征在于，包括下列步骤：
2、s1、将grna靶点序列设计在斑马鱼 snapc4基因的氨基酸结构域上，sgrna具体序列为编码链上的gagatcgaggtccagctctctgg或aactctatcttctcagtacctgg或者ctagggtcctccagctaatgagg或者gataaaatcgcagaggctcttgg，合成引物；
3、s2、以pmd19- gata5_grna scaffold载体为模板，使用步骤s1中的引物制备grna体外转录模板；
4、s3、将步骤s2的grna体外转录模板进行体外转录、纯化回收获得grna；
5、s4、将步骤s3回收获得grna和cas9 mrna新鲜混合,使grna终浓度达到320 ng/μl,cas9 mrna达到800 ng/μl后显微注射入单细胞期斑马鱼胚胎，每个靶点注射180～220枚；
6、s5、收集步骤s4注射入单细胞期斑马鱼胚胎完成72小时后的斑马鱼胚胎，提取基因组，pcr扩增目标片段，测序，测序结果为双峰的注射批次胚胎进入饲养系统（北京 爱生公司），饲养待性成熟时通过筛选其下一代胚胎检测有效突变类型斑马鱼，从而获得 snapc4突变斑马鱼；
7、s6、取步骤s5的 snapc4突变斑马鱼，胚胎完成6天时的 snapc4突变斑马鱼进行鱼消化道蠕动实时活体荧光成像检查；
8、s7、取步骤s5的 snapc4突变斑马鱼，胚胎完成7天时的 snapc4突变斑马鱼进行病理分析；
9、s8、通过对步骤s6、步骤s7获得数据进行分析描述 snapc4突变斑马鱼的发病情况。
10、对于上述模型建立的步骤进行进一步的优化，具体如下：
11、所述步骤s1中sgrna选用具体序列为编码链上的gataaaatcgcagaggctcttgg。其序列直接对应mrna的序列，编码蛋白质。
12、所述步骤s1中将grna靶点序列设计在斑马鱼 snapc4基因的氨基酸结构域。
13、所述s4中grna和cas9 mrna新鲜混合后显微注射入单细胞期斑马鱼胚胎，grna为320 ng/μl, cas9 mrna为800 ng/μl。
14、所述步骤s5中测序结果为双峰的注射批次胚胎进入饲养系统，饲养待性成熟时通过筛选其下一代胚胎检测有效突变类型斑马鱼。
15、所述步骤s6中荧光显微镜观察状况方法：取步骤s5中 snapc4突变斑马鱼选择6dpf 的斑马鱼幼鱼并将其置于6孔板中进行染色。向每孔中加入 4ml 斑马鱼培养养殖水，然后加入dmso染料，使最终浓度达到 1mg/l。染色 24 小时后，使用斑马鱼培养养殖水进行3 次洗涤本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法，其特征在于，包括下列步骤：
2.如权利要求1所述的用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法，其特征在于：所述步骤S1中sgRNA选用具体序列GATAAAATCGCAGAGGCTCTTGG。
3.如权利要求2所述的用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法，其特征在于，还包括如下步骤：
4.如权利要求3所述的用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法，其特征在于：所述步骤S1中sgRNA选用具体序列的合成和读取为核苷酸中五碳糖的尾端，带有羟基。
5.如权利要求3所述的用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法，其特征在于：所述步骤S1中将gRNA靶点序列设计在斑马鱼snapc4基因的氨基酸结构域。
6.如权利要求3所述的用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法，其特征在于：所述S4中gRNA和Cas9 mRNA新鲜混合后显微注射入单细胞期斑马鱼胚胎，gRNA为320 ng/μL, Cas9 mRNA为800 ng/μL。
7.如权利要求3所述的用于模拟十二指肠
8.如权利要求3-6任一项所述的用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法，其特征在于，所述步骤S6中荧光显微镜观察状况方法：取步骤S5中snapc4突变斑马鱼选择6dpf 的斑马鱼幼鱼并将其置于6孔板中进行染色，向每孔中加入 4mL 斑马鱼培养养殖水，然后加入DMSO染料，使最终浓度达到 1mg/L，染色 24 小时后，使用斑马鱼培养养殖水进行3 次洗涤，并在洗涤后使用低熔点胶固定样本，最后使用体视显微镜进行拍照。
9.如权利要求7所述的用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法，其特征在于，所述步骤S7中snapc4突变斑马鱼幼鱼进行病理分析：将snapc4突变斑马鱼幼鱼投入 4%多聚甲醛固定48h，并依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片时切片厚度为4 μm，HE染色，明场显微镜观察消化道病理情况。
10.如权利要求8所述的用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法，其特征在于：所述snapc4突变斑马鱼幼鱼为发育到6-7天大。
...【技术特征摘要】
1.用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法，其特征在于，包括下列步骤：
2.如权利要求1所述的用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法，其特征在于：所述步骤s1中sgrna选用具体序列gataaaatcgcagaggctcttgg。
3.如权利要求2所述的用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法，其特征在于，还包括如下步骤：
4.如权利要求3所述的用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法，其特征在于：所述步骤s1中sgrna选用具体序列的合成和读取为核苷酸中五碳糖的尾端，带有羟基。
5.如权利要求3所述的用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法，其特征在于：所述步骤s1中将grna靶点序列设计在斑马鱼snapc4基因的氨基酸结构域。
6.如权利要求3所述的用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立方法，其特征在于：所述s4中grna和cas9 mrna新鲜混合后显微注射入单细胞期斑马鱼胚胎，grna为320 ng/μl, cas9 mrna为800 ng/μl。
7.如权利要求3所述的用于模拟十二指肠梗阻的斑马鱼模型的建立...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄秀峰，夏雨寒，伍逸清，林振浪，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第二医院温州医科大学附属育英儿童医院，
类型：发明
国别省市：
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