【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，尤其是涉及一种提高脐带血来源nk细胞杀伤力的方法及其应用。
技术介绍
1、近年来，免疫细胞治疗作为一种新兴的治疗策略，在肿瘤免疫治疗、感染性疾病、免疫性疾病等多个领域显示出巨大的应用潜力。与传统的治疗方法（如化疗、放疗）相比，免疫细胞治疗具有明显的优势。首先，免疫细胞治疗能够特异性地识别并杀伤肿瘤细胞，减少正常细胞的损伤，从而降低副作用和毒性反应。其次，免疫细胞在治疗过程中可以通过不断增殖和持续的免疫监视，发挥长期的抗肿瘤效果。此外，免疫细胞具有高度的可塑性和适应性，能够有效应对肿瘤免疫逃逸机制。随着免疫细胞治疗技术的不断发展，尤其是通过细胞因子工程、基因编辑等手段对免疫细胞功能的进一步增强，免疫治疗的效果得到了显著提高。
2、免疫细胞中的自然杀伤细胞（natural killer cell，nk cell），凭借其高效的靶向杀伤能力和低副作用的特点，成为肿瘤免疫治疗的重要组成部分。nk细胞属于固有免疫系统的一部分，与t细胞和b细胞等适应性免疫细胞不同，nk细胞是通过识别和直接杀伤变异细胞（如肿瘤细胞和被病毒感染的细胞）来发挥免疫防御作用，而无需依赖于抗原的呈递或免疫记忆。nk细胞的这一特点使得它们在肿瘤免疫治疗、病毒感染以及其他免疫相关疾病的治疗中具有巨大的潜力。相比其他免疫细胞，nk细胞在免疫治疗中具有以下几项独特的优势：①无需抗原提呈：nk细胞能够通过其激活受体直接识别和杀伤不正常的细胞，无需依赖抗原呈递或特定的抗原识别；②对肿瘤免疫逃逸的突破能力：nk细胞能够识别缺失mhci分子的细胞
3、脐带血（umbilical cord blood, ucb）是胎儿出生时残留在脐带和胎盘中的血液，传统上被视为医疗废弃物。然而，随着对免疫细胞的研究深入，脐带血逐渐被发现是一种重要的生物医学资源。由于其独特的细胞组成，脐带血在多个医学领域得到了广泛应用，主要包括：造血干细胞移植、免疫治疗、组织修复和自体或异体细胞存储。同时，脐带血中也存在有大量的原始的nk细胞，称之为脐带血nk细胞（umbilical cord blood naturalkiller cell，ucb-nk）。
4、外泌体（exosomes）是一种纳米级（30-150nm）的小囊泡，属于细胞外囊泡（extracellular vesicles, evs）的一种，由细胞通过内吞途径形成并释放至细胞外环境。外泌体内含多种生物活性分子，包括蛋白质、脂质、mrna、mirna等，能够在细胞间传递信号，调节免疫反应和细胞行为。脐带血血浆富含外泌体，这些外泌体来源于多种细胞类型，如免疫细胞、造血干细胞、间充质干细胞等。由于其来源的特殊性，脐带血血浆中的外泌体在免疫调节、抗炎作用和组织修复方面表现出独特的优势。
5、目前，临床应用的nk细胞大多来源于外周血，而脐带血来源的nk细胞由于获取难度和技术限制，尚未被广泛应用。即使在少数应用中，脐带血nk细胞通常是单独使用，或与特定抗体药物联合治疗。然而，单独使用脐带血nk细胞往往难以达到理想的治疗效果，而与抗体药物联合使用虽然可增强疗效，但会显著增加患者的经济负担，并可能引发额外的副作用。因此，本专利技术将提出一种脐带血nk细胞与其血浆来源的外泌体联合应用的方法，以提高nk细胞的杀伤力。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术旨在提出一种提高脐带血来源nk细胞杀伤力的方法及其应用，该方法利用外泌体天然富含的免疫调节因子（如il-15、il-21）促进nk细胞的扩增和活化，并增强其杀伤力；此外，外泌体能够改善肿瘤微环境，减少免疫抑制，使nk细胞在体内外具有更强的持续杀伤能力。与单独使用nk细胞相比，该方法可显著提高抗肿瘤效果，为免疫细胞治疗提供了一种更加安全、高效、经济的策略。
2、为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、一种提高脐带血来源nk细胞杀伤力的方法，该方法包括如下步骤：
4、s1、从脐带血血浆中分离提取外泌体；
5、s2、从脐带血血浆中分离出单个核细胞，接着加入il-2、il-15、il-21，并每48小时，按照细胞数：外泌体颗粒数=1:5-1:15向培养体系中添加s1得到的脐带血血浆外泌体，以促进nk细胞扩增效率，收集所得nk细胞；
6、s3、将s2得到的nk细胞按照细胞数：外泌体颗粒数等于1:5-1:15的比例添加s1得到的脐带血血浆外泌体共孵育。
7、进一步，s1的具体方法为：将抗凝脐带血加入羟乙基淀粉沉淀红细胞，低速离心后取上层血浆层；然后将血浆层经过高速离心后，去除血浆中含有的杂质蛋白，再经过若干次超滤膜过滤去除血浆中所含的免疫球蛋白、白蛋白后进行超速离心后，收集血浆外泌体。
8、更进一步，s1的具体步骤为：
9、s11、向抗凝脐带血中添加1/4脐带血体积的质量分数6%羟乙基淀粉，充分混匀后静置15-20min；
10、s12、750rpm低速离心10min去除红细胞沉淀；
11、s13、上层血浆以4000rpm高速离心30min去除杂质细胞及细胞碎片；
12、s14、平衡超滤杯及超滤管；
13、s15、澄清血浆悬液用500kda的超滤管过滤离心4000g，30min，去除免疫球蛋白分子，收集上层悬液；
14、s16、用100kda的超滤管过滤离心4000g，30min，去除绝大部分白蛋白分子，收集上层悬液；
15、s17、将上层悬液进行100000g超速离心1.5小时，收集下层外泌体。
16、进一步，s2中，il-2的浓度为50-300u/ml，il-15的浓度为5-20ng/ml，il-21的浓度为5-20ng/ml。
17、进一步，s2中，细胞密度为1-1.5×106个/ml；并且，每48小时对细胞进行计数，补加nk细胞完全培养基使细胞密度维持在1-1.5×106个/ml。
18、进一步，s2中，每48小时还要补加il-2、il-15、il-21至初始浓度，并于每48小时向培养体系中添加脐带血血浆外泌体1-1.5×107颗粒/ml。
19、进一步，s2中，对细胞进行14-21本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高脐带血来源NK细胞杀伤力的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的提高脐带血来源NK细胞杀伤力的方法，其特征在于：S1的具体方法为：将抗凝脐带血加入羟乙基淀粉沉淀红细胞，低速离心后取上层血浆层；然后将血浆层经过高速离心后，去除血浆中含有的杂质蛋白，再经过若干次超滤膜过滤去除血浆中所含的免疫球蛋白、白蛋白后，进行超速离心后，收集血浆外泌体。
3.根据权利要求1所述的提高脐带血来源NK细胞杀伤力的方法，其特征在于：S2中，IL-2的浓度为50-300U/mL，IL-15的浓度为5-20ng/mL，IL-21的浓度为5-20ng/mL。
4.根据权利要求1所述的提高脐带血来源NK细胞杀伤力的方法，其特征在于：S2中，细胞密度为1-1.5×106个/mL；并且，每48小时对细胞进行计数，补加NK细胞完全培养基使细胞密度维持在1-1.5×106个/mL。
5.根据权利要求4所述的提高脐带血来源NK细胞杀伤力的方法，其特征在于：S2中，每48小时还要补加IL-2、IL-15、IL-21至初始浓度，并于每48小
6.根据权利要求1所述的提高脐带血来源NK细胞杀伤力的方法，其特征在于：S2中，对细胞进行14-21天的培养，直至细胞生长进入平台期。
7.根据权利要求1所述的提高脐带血来源NK细胞杀伤力的方法，其特征在于：S3中，共孵育不超过24小时。
8.一种由权利要求1-7任一项所述的提高脐带血来源NK细胞杀伤力的方法所得到的NK细胞在杀伤肿瘤细胞方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种提高脐带血来源nk细胞杀伤力的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的提高脐带血来源nk细胞杀伤力的方法，其特征在于：s1的具体方法为：将抗凝脐带血加入羟乙基淀粉沉淀红细胞，低速离心后取上层血浆层；然后将血浆层经过高速离心后，去除血浆中含有的杂质蛋白，再经过若干次超滤膜过滤去除血浆中所含的免疫球蛋白、白蛋白后，进行超速离心后，收集血浆外泌体。
3.根据权利要求1所述的提高脐带血来源nk细胞杀伤力的方法，其特征在于：s2中，il-2的浓度为50-300u/ml，il-15的浓度为5-20ng/ml，il-21的浓度为5-20ng/ml。
4.根据权利要求1所述的提高脐带血来源nk细胞杀伤力的方法，其特征在于：s2中，细胞密度为1-1.5×106个/m...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏卿，肖海蓉，刘庆喜，房帅，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司细胞科技分公司，
类型：发明
国别省市：
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