【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水体中微囊藻毒素检测，具体涉及一种crispr-cas12a传感器及其联合妊娠试纸检测水体中mc-lr的方法。
技术介绍
1、微囊藻毒素lr(mc-lr)是已知毒性最强的淡水蓝藻毒素之一，具有强烈的肝脏毒性，它能够强烈抑制蛋白磷酸酶的活性，对肝脏细胞造成损害，可能导致肝脏肿大、出血和坏死等病理变化；此外，mc-lr还是强烈的肝脏肿瘤促进剂，长期饮用可能增加患肝癌的风险。除了肝脏毒性外，mc-lr还具有肾脏毒性、生殖毒性、神经毒性和遗传毒性等，对多种器官和系统造成损害。mc-lr广泛分布于富营养化的淡水湖泊、水库和河流等水体，对人体健康和环境均具有较大威胁。因此，对mc-lr的检测尤其重要。
2、现有技术可以通过等离子体氧化石墨烯(p-go)实时组装适体传感器的方法，超灵敏检测微囊藻毒素lr；其主要由两部分组成，一是借助生物素/亲和素组装的mc-lr适配体的集合体，用于识别靶标物；二是连有适配体互补链的空心纳米板agclau和p-go的复合物，可以增强拉曼信号。此外，检测溶液中加入拉曼信号分子以产生sers信号；该方案通过调整mc-lr与适配体的互补链两者对适配体的竞争程度，实时调控两部分的组装方式与结果，从而产生不同的sers信号；其缺陷在于材料制备条件苛刻、过程复杂、成本较高，无法脱离大型设备，不适用于现场即时分析。
3、现有技术还可以基于间接竞争免疫进行分析，利用发散波光纤的全内反射性质，实现超微量毒素分析；mc-lr和单克隆mc-lr抗体共同孵育，占据识别位点；当反应液加入检测池后，探
4、此外，现有技术还可以基于crispr-cas12a的灵敏传感器用于定量检测真实水样中的mc-lr；具体地，mc-lr适配体附着在磁珠(mbs)上，并与阻断dna链杂交；在识别水样中的mc-lr分子后，阻断dna即被释放，与cas12a/crrna结合激活酶切活性；激活的cas12a以荧光标记的ssdna底物为报告物，获得荧光信号。此外，通过替换报告分子，用专用试纸条直接观察mc-lr含量。这一方法虽然克服了免疫分析的缺陷，提高了检测准确度。但检测过程中仍要用到小型荧光计，所用专用试纸条定量效果差、造价高、通用性差。
5、因此，开发一种准确性高，适用于现场检测，且成本低的mc-lr检测方法是有必要的。
技术实现思路
1、本专利技术基于crispr-cas12a传感器开发了一种mc-lr检测方法，本专利技术检测方法是基于crispr-cas12a传感器反式切割(trans-cleavage)能力、阳离子表面活性剂与含部分杂交双链的长链的结合能力、ctab触发hcg释放能力以及hcg与妊娠试剂的结合能力开发得到，可以快速，且准确的实现mc-lr的检测，且不需要专门的检测试纸，使用商用的妊娠试纸即可，成本低。
2、为了达到上述目的，本专利技术可以采用以下技术方案：
3、本专利技术一方面提供一种crispr-cas12a传感器，包括cas12a、crrna、cas12a激活链和mc-lr适配体；其中，crrna的序列如seq id no:1所示；和/或cas12a激活链如seq id no:2所示；和/或mc-lr适配体的序列如seq id no:3所示。
4、本专利技术另一方面提供一种水体中mc-lr的检测试剂或检测试剂盒，包括分别独立包装的本专利技术中的crispr-cas12a传感器、含部分杂交双链的长链、阳离子表面活性剂或其溶液、负载hcg试剂和hcg检测试剂；其中，crispr-cas12a传感器包括cas12a、crrna、cas12a激活链和mc-lr适配体。
5、优选地，上述检测试剂或检测试剂盒满足以下条件中的一种或多种：
6、(a)crrna的序列如seq id no:1所示；和/或cas12a激活链如seq id no:2所示；和/或mc-lr适配体的序列如seq id no:3所示；
7、(b)含部分杂交双链的长链中，长单链的序列如seq id no:4所示，短单链的序列如seq id no:5所示；
8、(c)含部分杂交双链的长链中，固定连接磁珠；
9、(e)检测试剂或检测试剂盒还包括水体样本预处理试剂；
10、(f)负载hcg试剂为负载hcg的碳酸钙球霰石；
11、(g)阳离子表面活性剂为ctab。
12、更优选地，上述含部分杂交双链的长链中，长链和短链的投料摩尔比为1:4。
13、更优选地，上述负载hcg的碳酸钙球霰石的制备方法包括：将cacl2溶液与hcg溶液混合，超声；然后迅速加入na2co3溶液反应得反应物；将反应物洗涤，乙醇溶解，干燥得负载hcg的碳酸钙球霰石；其中，hcg溶液由tris-hcl配制而得。
14、本专利技术再提供一种检测水体中mc-lr的方法，其包括使用本专利技术中的检测试剂或检测试剂盒进行检测。
15、优选地，上述方法包括：(1)将crispr-cas12a传感器与待检测水样混合得混合液1；含部分杂交双链的长链和阳离子表面活性剂或其溶液混合得混合液2；(2)混合液1和混合液2混合反应得反应物；(3)反应物分离得上清液1；上清液1与负载hcg试剂混合，离心得上清液2；(4)通过hcg检测试剂测试上清液2中hcg含量，从而定性或定量检测水体中mc-lr。
16、更优选地，hcg检测试剂为妊娠试纸，步骤(4)中，使用妊娠试纸检测上清液2，根据检测线的情况进行定性或定量分析。
17、更优选地，根据检测线的情况进行定量分析，包括：(i)将试纸条检测线出现后进行拍照分析，得到试纸条检测线区域灰度值；(ii)根据纸条检测线区域灰度值与标准mc-lr浓度的工作曲线获得待检测水样中mc-lr浓度。
18、优选地，上述方法中，将待检测水样中的mc-lr进行富集后再与crispr-cas12a传感器进行混合。
19、本专利技术有益效果包括：基于本专利技术提供的基于crispr-cas12a传感器及其联合妊娠试纸检测水体中mc-lr的方法避免使用大型仪器设备，无需专业人员参与，更适合现场检测；解决了现有试纸条检测方法灵敏度不足、不适用于定量分析的问题；此外，本专利技术可以通过现有的商业的妊娠试纸条进行检测，缩短了研发与市场转化周期，降低了成本。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种CRISPR-Cas12a传感器，其特征在于，包括Cas12a、crRNA、Cas12a激活链和MC-LR适配体；其中，crRNA的序列如SEQ ID NO:1所示；和/或Cas12a激活链如SEQ ID NO:2所示；和/或MC-LR适配体的序列如SEQ ID NO:3所示。
2.水体中MC-LR的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，包括分别独立包装CRISPR-Cas12a传感器、含部分杂交双链的长链、阳离子表面活性剂或其溶液、负载HCG试剂和HCG检测试剂；CRISPR-Cas12a传感器包括Cas12a、crRNA、Cas12a激活链和MC-LR适配体。
3.根据权利要求2所述的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，检测试剂或检测试剂盒满足以下条件中的一种或多种：
4.根据权利要求3所述的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，含部分杂交双链的长链中，长链和短链的投料摩尔比为1:4。
5.根据权利要求3或4所述的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，负载HCG的碳酸钙球霰石的制备方法包括：将CaCl2溶液与HCG溶液混合，超声；然后
6.一种检测水体中MC-LR的方法，其特征在于，包括使用权利要求3至5中任一项权利要求所述的检测试剂或检测试剂盒进行检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于包括：(1)将CRISPR-Cas12a传感器与待检测水样混合得混合液1；含部分杂交双链的长链和阳离子表面活性剂或其溶液混合得混合液2；(2)混合液1和混合液2混合反应得反应物；(3)反应物分离得上清液1；上清液1与负载HCG试剂混合，离心得上清液2；(4)通过HCG检测试剂测试上清液2中HCG含量，从而定性或定量检测水体中MC-LR。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，HCG检测试剂为妊娠试纸，步骤(4)中，使用妊娠试纸检测上清液2，根据检测线的情况进行定性或定量分析。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，根据检测线的情况进行定量分析，包括：(i)将试纸条检测线出现后进行拍照分析，得到试纸条检测线区域灰度值；(ii)根据纸条检测线区域灰度值与标准MC-LR浓度的工作曲线获得待检测水样中MC-LR浓度。
10.根据权利要求7至9中任一项权利要求所述的方法，其特征在于，将待检测水样中的MC-LR进行富集后再与CRISPR-Cas12a传感器进行混合。
...【技术特征摘要】
1.一种crispr-cas12a传感器，其特征在于，包括cas12a、crrna、cas12a激活链和mc-lr适配体；其中，crrna的序列如seq id no:1所示；和/或cas12a激活链如seq id no:2所示；和/或mc-lr适配体的序列如seq id no:3所示。
2.水体中mc-lr的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，包括分别独立包装crispr-cas12a传感器、含部分杂交双链的长链、阳离子表面活性剂或其溶液、负载hcg试剂和hcg检测试剂；crispr-cas12a传感器包括cas12a、crrna、cas12a激活链和mc-lr适配体。
3.根据权利要求2所述的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，检测试剂或检测试剂盒满足以下条件中的一种或多种：
4.根据权利要求3所述的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，含部分杂交双链的长链中，长链和短链的投料摩尔比为1:4。
5.根据权利要求3或4所述的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，负载hcg的碳酸钙球霰石的制备方法包括：将cacl2溶液与hcg溶液混合，超声；然后迅速加入na2co3溶液反应得反应物；将反应物洗涤，乙醇溶解，干燥得负载hcg的碳酸钙球霰石；其中，hcg溶液由tris-...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽赏，苏杭，陈晋荣，贺强，张书圣，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。