【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物样本保存，具体涉及一种适用于多类型微生物样本的dna保存液及应用。
技术介绍
1、随着微生物研究在疾病发展中的重要性日益凸显，众多常见的疾病如糖尿病、哮喘、慢性腹泻、肠易激综合症(ibs)、炎症性肠道病(ibd)、肥胖症、免疫力低下等均被发现与微生物分布平衡的紊乱失调有着密切关联。通过样品采集、提取微生物总dna、qpcr、16srrna、宏基因组测序以及一系列生物信息学可分析人体微生物构成，进一步研究菌群与人体健康疾病之间的关系。然而，微生物样本成分十分复杂，离开人体后，其所处环境发生了极大变化，部分细菌因环境剧烈变化死亡、部分细菌则保持活性不断代谢和生长，这些都会对后续的菌群数据分析产生极大影响。另外，微生物样本含有大量的消化残余及细菌产生的各种核酸降解酶如蛋白酶、dna酶(dnases)和rna酶(rnases)、各种pcr抑制剂(如胆盐、胆红素、腐殖质和色素)，使得微生物样本中的细胞及核酸极易受到破坏和降解。除此之外，样品收集、运输、储存、dna提取、测序和生物计量分析等均会对微生物多样性和组成造成干扰。因此，如何准确且快速地获得并保存样本，对于人体微生物的研究具有深远意义。
2、冷冻保存法(-80℃)被认为是大多数生物样本微观生物研究中的金标准。然而，受制于取样环境和保存样本特殊设备，冷冻保存法适用范围固定，且设备投入高，运行成本高，市场上对室温保存样本需求日益增加。目前，已经开发出了商业和实验用的粪便样本保存试剂，中国专利cn115466682 a提供的微生物保存液为微生物保存提供载体
3、为解决上述问题，本专利技术提供一种能够有效保持固体微生物样本(粪便)、液体微生物样本(唾液微生物)及微量微生物样本(皮肤微生物、口腔粘膜微生物、牙菌斑微生物、女性生殖道微生物等)中微生物稳定，降低微生物dna核酸降解，实现不同类型样本常温储存的微生物dna保存液，适用样本范围广泛。
技术实现思路
1、本专利技术的一个目的是提供一种用于多类型微生物样本保存的dna保存液及其制备方法；本专利技术第二个目的时提供所述dna保存液的用途；本专利技术还有一个目的时提供一种使用所述dna保存液对微生物样本进行保存的方法。
2、本专利技术的目的通过如下技术方案实现：
3、在本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种微生物样本dna保存液，其特征在于，所述每升dna保存液包括以下组分：甘油5-30％(v/v)、乙二胺四乙酸二钠0.02-0.2mol/l、三羟甲基氨基甲烷0.01-0.1mol/l、核酸稳定剂或核酸酶抑制剂0.01-0.05mol/l，盐酸调ph至5.6-7.6，余量为水。
4、所述核酸稳定剂选自焦磷酸钠、三聚磷酸钠、抗坏血酸钠、六偏磷酸钠、磷酸三钠、柠檬酸钠中的一种或两种以上的组合。
5、所述核酸酶抑制剂选自焦磷酸二乙酯(depc)、异硫氰酸胍、尿素中的一种或两种以上的组合。
6、优选的，所述每升dna保存液由如下组分组成：甘油5-30％(v/v)、乙二胺四乙酸二钠0.02-0.2mol/l、三羟甲基氨基甲烷0.01-0.1mol/l、核酸稳定剂0.01-0.05mol/l，盐酸调ph至5.6-7.6，余量为水；所述核酸稳定剂选自焦磷酸钠、三聚磷酸钠、抗坏血酸钠中的一种。
7、更优选的，所述每升dna保存液由如下组分组成：甘油5-15％(v/v)、乙二胺四乙酸二钠0.05-0.2mol/l、三羟甲基氨基甲烷0.06-0.1mol/l、核酸稳定剂0.01-0.03mol/l，盐酸调ph至7.0-7.5，余量为水；所述核酸稳定剂选自焦磷酸钠。
8、在本专利技术的一个具体实施方式中，每升dna保存液由如下组分组成：甘油5％(v/v)、乙二胺四乙酸二钠0.2mol/l、三羟甲基氨基甲烷0.1mol/l、焦磷酸钠0.03mol/l，盐酸调ph至7.5，余量为水。
9、在本专利技术的一个具体实施方式中，每升dna保存液由如下组分组成：甘油10％(v/v)、乙二胺四乙酸二钠0.05mol/l、三羟甲基氨基甲烷0.06mol/l、焦磷酸钠0.01mol/l，盐酸调ph至7.1，余量为水。
10、在本专利技术的一个具体实施方式中，每升dna保存液由如下组分组成：甘油15％(v/v)、乙二胺四乙酸二钠0.1mol/l、三羟甲基氨基甲烷0.08mol/l、焦磷酸钠0.02mol/l，盐酸调ph至7.1，余量为水。
11、在本专利技术的第二方面，本专利技术提供一种微生物样本dna保存液的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
12、(1)以1升dna保存液计，取甘油50-300ml，乙二胺四乙酸二钠0.02-0.2mol，三羟甲基氨基甲烷0.01-0.1mol，焦磷酸钠0.01-0.05mol；
13、(2)取部分无菌水溶解焦磷酸钠，使用孔径为0.22μm的微滤膜过滤，备用；
14、(3)取部分无菌水溶解乙二胺四乙酸二钠和三羟甲基氨基甲烷，与甘油混合，置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，冷却至室温后加入步骤(2)中的焦磷酸钠溶液，使用无菌水补足体积至1l。
15、优选的，步骤(3)中高压蒸汽灭菌锅的灭菌压力为103.4-104.4kpa，温度为121.3-122.0℃，灭菌时间为15-20min。
16、在本专利技术的最优选实施方式中，高压蒸汽灭菌锅的灭菌压力为103.4kpa，温度为121.3℃，灭菌时间为15min。
17、在本专利技术的第三方面，本专利技术提供一种dna保存液在非冻条件下保存微生物样本中的应用。
18、所述非冻条件选自温度>0℃的保存条件。
19、在本专利技术的优选实施方式中，所述非冻条件选自温度为25-37℃的保存条件。
20、所述微生物样本选自本领域技术人员熟知的固体微生物样本、液体微生物样本和微量微生物样本。
21、在本专利技术的一些实施方式中，所述固体微生物样本选自粪便样本。
22、在本专利技术的一些实施方式中，所述液体微生物样本选自血液样本、唾液样本、尿液样本或脑脊液样本。
23、在本专利技术的一些实施方式中，所述微量样本选自皮肤组织样本、口腔黏膜样本、牙菌斑样本或生殖道分泌物样本。
24、在本专利技术的第四方面，本专利技术提供一种微生物样本的保存方法，其特征在于，将本专利技术提供的dna保存液与微生物样本按照体积比(1-5)：1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种微生物样本DNA保存液，其特征在于，所述每升DNA保存液包括以下组分：甘油5-30％(v/v)、乙二胺四乙酸二钠0.02-0.2mol/L、三羟甲基氨基甲烷0.01-0.1mol/L、核酸稳定剂或核酸酶抑制剂0.01-0.05mol/L，盐酸调pH至5.6-7.6，余量为水。
2.根据权利要求1所述的DNA保存液，其特征在于，所述核酸稳定剂选自焦磷酸钠、三聚磷酸钠、抗坏血酸钠、六偏磷酸钠、磷酸三钠、柠檬酸钠中的一种或两种以上的组合；所述核酸酶抑制剂选自焦磷酸二乙酯、异硫氰酸胍、尿素中的一种或两种以上的组合。
3.根据权利要求2所述的DNA保存液，其特征在于，所述每升DNA保存液由如下组分组成：甘油5-30％(v/v)、乙二胺四乙酸二钠0.02-0.2mol/L、三羟甲基氨基甲烷0.01-0.1mol/L、核酸稳定剂0.01-0.05mol/L，盐酸调pH至5.6-7.6，余量为水；所述核酸稳定剂选自焦磷酸钠、三聚磷酸钠、抗坏血酸钠中的一种。
4.根据权利要求2所述的DNA保存液，其特征在于，所述每升DNA保存液由如下组分组成：甘油5-1
5.一种权利要求1-4任一项所述的微生物样本DNA保存液的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
6.一种权利要求1-4任一项所述的微生物样本DNA保存液在非冻条件下保存微生物样本中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述非冻条件选自温度>0℃的保存条件。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述非冻条件选自温度为25-37℃的保存条件。
9.一种微生物样本的保存方法，其特征在于，将权利要求1-4任一项所述的微生物样本DNA保存液与微生物样本按照体积比(1-5)：1混合，保存。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在室温条件下，保存28-30天；在37℃条件下，保存7-28天。
...【技术特征摘要】
1.一种微生物样本dna保存液，其特征在于，所述每升dna保存液包括以下组分：甘油5-30％(v/v)、乙二胺四乙酸二钠0.02-0.2mol/l、三羟甲基氨基甲烷0.01-0.1mol/l、核酸稳定剂或核酸酶抑制剂0.01-0.05mol/l，盐酸调ph至5.6-7.6，余量为水。
2.根据权利要求1所述的dna保存液，其特征在于，所述核酸稳定剂选自焦磷酸钠、三聚磷酸钠、抗坏血酸钠、六偏磷酸钠、磷酸三钠、柠檬酸钠中的一种或两种以上的组合；所述核酸酶抑制剂选自焦磷酸二乙酯、异硫氰酸胍、尿素中的一种或两种以上的组合。
3.根据权利要求2所述的dna保存液，其特征在于，所述每升dna保存液由如下组分组成：甘油5-30％(v/v)、乙二胺四乙酸二钠0.02-0.2mol/l、三羟甲基氨基甲烷0.01-0.1mol/l、核酸稳定剂0.01-0.05mol/l，盐酸调ph至5.6-7.6，余量为水；所述核酸稳定剂选自焦磷酸钠、三聚磷酸钠、抗坏血酸钠中的一种。
4.根据权利要求2所述的dna保存液，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：王帅，孙子奎，李威，
申请(专利权)人：上海派森诺医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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