【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学检测，尤其涉及一种改进的检测组织切片中vista蛋白的免疫组织化学方法。
技术介绍
1、vista(v-domain immunoglobulin suppressor of t cell activation,t细胞激活抑制物免疫球蛋白v区结构域)是近年来新发现的一个免疫抑制性检查点分子，与pd-l1结构类似，同属于b7家族免疫检查点。vista可表达于t淋巴细胞(包括cd4+和cd8+t淋巴细胞)，并显著高表达于髓系来源的单核/巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞，也可见于某些肿瘤细胞。vista主要通过抑制t细胞激活，从而使肿瘤细胞逃避机体免疫的识别和攻击，特异性阻断vista可显著增强抗肿瘤免疫反应。但传统的免疫组织化学法(ihc)检测vista在结直肠癌组织中的表达效果不佳，vista在结直肠癌肿瘤细胞中的阳性检出率仅为1.8-2.6％。因此，增强结直肠癌组织中vista的免疫组织化学(ihc)检测灵敏度，尤其是提升结直肠癌细胞中vista的阳性检出率，对于精准识别可能从vista单克隆抗体治疗中获益的患者群体极为关键。
技术实现思路
1、为此，针对现有免疫组织化学法(ihc)检测vista在结直肠癌组织中的检测灵敏度的技术问题，本专利技术提供一种改进的检测组织切片中vista蛋白的免疫组织化学方法，其特征在于，所述方法包括去除vista的糖基化修饰的步骤。
2、其中，本专利技术在抗原修复步骤之后，灭活过氧化物酶步骤之前，包括去除vista的
3、优选地是，所述组织切片为肿瘤组织切片，优选为结直肠癌组织切片。
4、本专利技术的改进的检测组织切片中vista蛋白的免疫组织化学方法具体包括如下步骤：
5、步骤s1，将组织切片进行烘干并脱蜡处理；
6、步骤s2，将组织切片进行抗原修复；
7、步骤s3，糖蛋白变性并去除vista的糖基化修饰；
8、步骤s4，灭活过氧化物酶；
9、步骤s5，先封闭，再进行孵育一抗及二抗；
10、步骤s6，显色观察。
11、优选地，所述方法包括如下步骤：
12、步骤s1，将组织切片在60℃～65℃烘干85分钟～120分钟，然后用有机溶剂反复浸泡以脱蜡处理；
13、步骤s2，将组织切片用柠檬酸抗原修复液在微波炉中于解冻档下进行两次加热8～12分钟下进行抗原修复；
14、步骤s3，用糖蛋白变性缓冲液室温下孵育2.5～5小时以使得糖蛋白变性；然后用缓冲液稀释至5％的去糖基化酶在36～38℃下孵育过夜以去除vista的糖基化修饰；
15、步骤s4，用甲醇稀释后的过氧化氢溶液覆盖，并避光20～40分钟以灭活过氧化物酶；
16、步骤s5，先用4％～8％山羊血清室温下封闭50～80分钟，再4％～8％山羊血清配置vista一抗于4℃孵育过夜，复温后再用鼠兔通用型二抗于室温孵育50～80分钟；
17、步骤s6，显色观察。
18、优选地，所述方法包括如下步骤：
19、步骤s1，将肿瘤组织切片在63℃烘干90分钟，然后用有机溶剂反复浸泡以脱蜡处理；
20、步骤s2，将肿瘤组织切片用柠檬酸抗原修复液用微波炉在解冻档下进行两次加热10分钟下进行抗原修复；
21、步骤s3，用糖蛋白变性缓冲液室温下孵育3小时以使得糖蛋白变性，然后用pbs稀释至5％的去糖基化酶n-糖苷酶f(pngase f)在37℃下孵育过夜以去除vista的糖基化修饰；
22、步骤s4，用甲醇稀释至30％的过氧化氢溶液覆盖，并避光30分钟以灭活过氧化物酶；
23、步骤s5，先5％山羊血清室温下封闭1小时，再5％山羊血清配置vista一抗于4℃孵育过夜，复温后，再用鼠兔通用型二抗于室温孵育1小时；
24、步骤s6，显色观察。
25、优选地，步骤s1中所述的有机溶剂反复浸泡具体包括：
26、二甲苯浸泡5分钟，二甲苯二次浸泡5分钟，无水乙醇浸泡5分钟，无水乙醇二次浸泡5分钟，95％乙醇浸泡3分钟，95％乙醇二次浸泡3分钟，75％乙醇浸泡3分钟，75％乙醇二次浸泡3分钟。
27、优选地，
28、步骤s1中，脱蜡处理后用清水清洗4～10分钟；
29、步骤s2中，在两次微波炉加热之后，分别进行冷却至室温；抗原修复之后，用缓冲液清洗3～5次，每次4～10分钟；
30、步骤s3中，糖蛋白变性缓冲液为含40mm dtt(dithiothreitol，二硫苏糖醇)的0.5％ sds(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠)溶液，糖蛋白变性后用缓冲液进行清洗3～5次，每次4～10分钟；去除vista的糖基化修饰之后用缓冲液进行清洗3～5次，每次4～10分钟；
31、步骤s4中，避光灭活之后，用缓冲液进行清洗3～5次，每次4～10分钟。
32、其中，所述缓冲液为pbs缓冲液。
33、其中，所述显色观察包括：dab显色、苏木素复染，透明封片和显微观察拍照。
34、本专利技术的积极进步效果在于：本专利技术结直肠癌组织切片中，去除vista的糖基化修饰之后，可以显著提高vista在免疫组织化学中的检出率。通过去糖基化处理，能更为有效的检测vista在结直肠癌组织中的表达，对于精准识别可能从vista单克隆抗体治疗中获益的患者群体极为关键。
35、以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。
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1.一种改进的检测组织切片中VISTA蛋白的免疫组织化学方法，其特征在于所述方法包括去除VISTA的糖基化修饰的步骤。
2.如权利要求1所述的改进的检测组织切片中VISTA蛋白的免疫组织化学方法，其特征在于在抗原修复步骤之后，灭活过氧化物酶步骤之前，包括去除VISTA的糖基化修饰的步骤。
3.如权利要求1或2所述的改进的检测组织切片中VISTA蛋白的免疫组织化学方法，其特征在于所述组织切片为肿瘤组织切片，优选为结直肠癌组织切片。
4.如权利要求2所述的改进的检测组织切片中VISTA蛋白的免疫组织化学方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
5.如权利要求4所述的改进的检测组织切片中VISTA蛋白的免疫组织化学方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
6.如权利要求5所述的改进的检测组织切片中VISTA蛋白的免疫组织化学方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
7.如权利要求6所述的改进的检测组织切片中VISTA蛋白的免疫组织化学方法，其特征在于步骤S1中所述的有机溶剂反复浸泡具体包括：
8.如权利要求6
9.如权利要求8所述的改进的检测组织切片中VISTA蛋白的免疫组织化学方法，其特征在于所述缓冲液为PBS缓冲液。
10.如权利要求5所述的改进的检测组织切片中VISTA蛋白的免疫组织化学方法，其特征在于所述显色观察包括：DAB显色、苏木素复染，透明封片和显微观察拍照。
...【技术特征摘要】
1.一种改进的检测组织切片中vista蛋白的免疫组织化学方法，其特征在于所述方法包括去除vista的糖基化修饰的步骤。
2.如权利要求1所述的改进的检测组织切片中vista蛋白的免疫组织化学方法，其特征在于在抗原修复步骤之后，灭活过氧化物酶步骤之前，包括去除vista的糖基化修饰的步骤。
3.如权利要求1或2所述的改进的检测组织切片中vista蛋白的免疫组织化学方法，其特征在于所述组织切片为肿瘤组织切片，优选为结直肠癌组织切片。
4.如权利要求2所述的改进的检测组织切片中vista蛋白的免疫组织化学方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
5.如权利要求4所述的改进的检测组织切片中vista蛋白的免疫组织化学方法，其特征在于所...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘辰莹，杜鹏，朱哲慧，丁睿，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属新华医院，
类型：发明
国别省市：
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