【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒学和生物，公开了snv株全长感染性克隆引物组、构建方法、突变体和应用。
技术介绍
1、禽网状内皮组织增殖症(reticuloendotheliosis，re)是由禽网状内皮组织增殖症病毒(reticuloendotheliosis virus，rev)引起的以免疫抑制为主的禽类疾病，属于逆转录科c型逆转录病毒属，是典型的γ逆转录病毒。rev主要引起以网状内皮细胞增生为主要特征的一组综合征，包括急性网状细胞增生症、矮小综合征和淋巴组织及其它组织的慢性肿瘤增生性疾病。
2、rev是一种单股正链rna病毒，主要包括gag、pol以及env和保守区ltrs等基因。gag蛋白是核衣壳蛋白，其主要功能是编码核心蛋白，它的特点是比较保守，抗原性强，可被病毒自身的酶裂解形成许多成熟的结构蛋白，包括基质蛋白p18(ma)、衣壳蛋白p30(ca)、核衣壳蛋白p10(nc)以及许多小蛋白，其中p30是主要的群特异性抗原，有装配病毒粒子的作用。囊膜蛋白(env)是包含gp20和gp90两个肽链的糖蛋白，较小的gp20是可以穿过病毒囊膜的穿模蛋白(tm)，而较大的gp90暴露在囊膜外，属于囊膜蛋白(su)，具有免疫原性，可使机体产生抗体。聚合酶蛋白(pol)主要编码病毒的蛋白酶(pr)、逆转录酶(rt)和整合酶(in)，是rev整个基因组里最保守的区域，其中蛋白酶的功能是水解一些前体蛋白，逆转录酶具有聚合酶活性，能以dna或rna为模板合成新的dna链，还具有rnade h活性，可切除逆转录的病毒rna模版，整合酶可将环状前
3、乙酰化是一种常见的ptm(post-translational modification)，可以调节转录、趋化、细胞信号转导、蛋白质水解、细胞凋亡等多个过程。大量研究表明，蛋白质乙酰化修饰已经被多种病毒利用，贯穿病毒生活周期的每一步。病毒入侵细胞后，利用宿主的乙酰化网络，破坏细胞的代谢和信号通路，从而调节自身的复制和感染。
4、突变分析常常用来确定乙酰化位点的重要性：通过将想要研究的赖氨酸(lysine，k)突变为精氨酸(arginine，r)来模拟去乙酰化赖氨酸，精氨酸具有与赖氨酸相近的正电荷和结构，同时不会发生乙酰化；将赖氨酸突变为谷氨酰胺(glutamine，q)来模拟乙酰化赖氨酸，谷氨酰胺可中和正电荷并且具有赖氨酸相近的结构。
5、反向遗传学技术是通过dna重组、核苷酸定点突变等技术，有目的地、精确地改造病毒基因结构，再借助体内外转录、转染等手段，在宿主细胞内包装并拯救出病毒的技术，可应用于病毒生物学、免疫学、致病性研究和新型疫苗研发等领域。该技术广泛应用于dna病毒、rna病毒等研究，病毒常用的反向遗
6、传技术有两种：一种是将病毒cdna插入真核表达载体后直接转染哺乳动物细胞从而拯救出病毒，二是将病毒全长cdna体外转录得到的病毒rna转染哺乳动物细胞进而拯救出病毒。由于拯救病毒的基因组来自全长cdna，因此可利用定点突变或同源重组技术，在dna水平上对病毒基因组进行切割、修饰或改造，通过拯救病毒的表型变化来判断病毒基因功能、病毒特性等。
技术实现思路
1、本专利技术的专利技术人针对现有技术存在的空白之处，根据rev-snv株基因组特点和自带的酶切位点，首次利用同源重组的方法，通过五次连接转化连接于克隆载体pbluescriptii ks(+)，并且通过定点突变技术，将k697位点进行了乙酰化和去乙酰化的突变，构建了rev-snv株全长感染性克隆pb-rev-snv、突变体pks-rev-snv-k697q和pks-rev-snv-k697r，并且实现了体外的病毒拯救和致病性研究；为rev致病性及697位点乙酰化的功能研究等方面提供平台。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种禽网状内皮组织增殖症病毒snv株全长感染性克隆引物组，具体序列如seq id no.1～12所示。
4、本专利技术还提供了一种禽网状内皮组织增殖症病毒snv株全长感染性克隆构建方法，包括以下步骤：
5、(1)提取rev-snv株病毒基因组总dna
6、(2)设计、合成覆盖全基因组的引物：根据rev-snv株全基因序列以及同源重组说明书设计引物，所述扩增引物为g1-f、g1-r、g1+-r、g2-f、g2-r、g2+-r、g3-f、g3-r、g3+-r、g4-f、g4-r、g4+-r，其中g1-f、g1+-r、g2+-r、g3-f、g3+-r、g4+-r含有质粒pbluescript iiks(+)的同源臂，g2-f、g4-f含有与rev序列的同源臂，引物g1-r、g2-r、g3-r、g4-r中引入mlui酶切位点；在g3+片段中引入遗传标记，突变引物为ycbj-f/ycbj-r；以上所述具体引物序列如seq id no.1～14所示；
7、(3)分别利用引物g1-f/g1-r、g2-f/g2-r、g3-f/g3-r、g4-f/g4-r，使用高保真酶对四个片段进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行检测和纯化回收，得到g1、g2、g3、g4四个片段；然后以得到的片段为模板再分别用引物g1-f/g1+-r、g2-f/g2+-r、g3-f/g3+-r、g4-f/g4+-r，使用高保真酶进行pcr扩增，再次对得到的扩增产物进行检测和纯化回收，得到g1+、g2+、g3+、g4+四个片段；
8、(4)先将质粒pbluescript ii ks(+)使用hind iii和kpn i进行双酶切处理后纯化获得目的片段pb-1，随后设计引物pks1-f/pks1-r，用高保真酶将片段pb-1进行扩增，对pcr扩增产物进行检测和纯化回收，得到pks-1片段，将得到的pks-1片段与g1+片段进行同源重组后转化至dh5α感受态细胞，挑取菌落后提取质粒，经双酶切及测序鉴定连接成功后对其进行扩繁，提取质粒，将得到的质粒命名为pks-g1；
9、(5)将重组质粒pks-g1用hind iii和mlu i双酶切，凝胶电泳后胶回收获得目的片段pb-2，随后设计引物pks2-f/pks2-r，用高保真酶将片段pb-2进行扩增，对pcr扩增产物进行检测和纯化回收，得到pks-2片段，将得到的pks-2片段与g2+片段进行同源重组后转化至dh5α感受态细胞，挑取菌落后提取质粒，经双酶切及测序鉴定连接成功后对其进行扩繁，提取质粒，将得到的质粒命名为pks-g1+g2；
10、(6)将所述的pks-1片段与g3+片段进行同源重组后转化至dh5α感受态细胞，挑取菌落后提取质粒，经双酶切及测序鉴定连接成功后对其进行扩繁，提取质粒，将过得的质粒命名为pks-3，为了后续构建的感染性克隆可以区别于野毒株，设计一对突变引物ycbj-f/ycbj-r，引入一个无义突变(g57本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种禽网状内皮组织增殖症病毒SNV株全长感染性克隆引物组，其特征在于，所述引物组的具体序列如SEQ ID No.1～12所示。
2.一种禽网状内皮组织增殖症病毒SNV株全长感染性克隆构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
3.两个禽网状内皮组织增殖症病毒SNV株的突变体，其特征在于，所述的突变体为pKS-REV-SNV-K697Q和pKS-REV-SNV-K697R，即在权利要求1所制备的质粒pKS-REV-SNV的氨基酸序列上第697位的赖氨酸突变为谷氨酰胺或精氨酸。
4.一种禽网状内皮组织增殖症病毒SNV株及突变株的拯救方法，其特征在于，首先将权利要求1所制备的重组质粒pKS-REV-SNV与转染试剂LipofectamineTM 3000混合，分别转染DF-1细胞，5d后收集细胞和上清，反复冻融三次后接种新的DF-1细胞，在5d后收获上清，即得到拯救病毒。
5.根据权利要求4所述的一种拯救方法，其特征在于，所述的转染试剂的成分及终浓度：LipofectamineTM 3000：质粒：P3000为6：5：5。
<...【技术特征摘要】
1.一种禽网状内皮组织增殖症病毒snv株全长感染性克隆引物组，其特征在于，所述引物组的具体序列如seq id no.1～12所示。
2.一种禽网状内皮组织增殖症病毒snv株全长感染性克隆构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
3.两个禽网状内皮组织增殖症病毒snv株的突变体，其特征在于，所述的突变体为pks-rev-snv-k697q和pks-rev-snv-k697r，即在权利要求1所制备的质粒pks-rev-snv的氨基酸序列上第697位的赖氨酸突变为谷氨酰胺或精氨酸。
4.一种禽网状内皮组织增殖症病毒snv株及突变株的拯救方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：王桂花，许婉晴，成子强，邢一科，童净如，魏殿丰，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：
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