【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种调控植物种子大小的基因、过表达载体、农杆菌及应用。
技术介绍
1、甘蓝型油菜(brassica napus)是油菜三大类型之一，由白菜(brassica rapa)和甘蓝(brassica oleracea)通过自然种间杂交而成。作为我国重要的油料作物之一，也是我国唯一的冬季油料作物，甘蓝型油菜具有较高的经济价值以及营养价值，不仅能用于生产食用油，同时也是高蛋白饲料、高能燃料等重要的工业原料。但是由于我国人口众多，种植面积有限，同时地形复杂，气候多变，病害、虫害等问题频发，严重限制了油菜的品质与产量。油菜产量的提高对解决我国的植物油资源紧缺等问题有极其重要的意义，有助于保障我国油料供给安全。千粒重是构成油菜产量的重要因素，而种子大小是影响千粒重的关键表型。对调控种子大小机制的研究可为作物育种提供重要的理论依据，也可利用调控种子大小的基因实现作物的增产。研究甘蓝型油菜种子大小的分子调控机制，对提高单位面积油菜产量进而提高单位面积产油量具有重要意义。
2、mapk(mitogen-activatedprotein kinase)级联不仅在植物生长发育中发挥重要作用，而且在对生物和非生物胁迫的反应方面也起着重要作用。mapk级联信号放大通过三种磷酸化激酶实现。最开始由mapkkks(mitogen-activated protein kinase kinasekinase)磷酸化mkks(mitogen-activated protein kinase kinase)中a-loop环上的
3、目前，关于调控种子大小的研究已有很多。例如，cn117402895a专利报道了甘蓝型油菜bnasap.a04基因及其在调控油菜种子大小中的应用。该专利初步研究了sap基因对油菜种子大小的调控作用，采用同源克隆方法，从甘蓝型油菜中克隆了sap同源基因bnasap.a04；然后构建了过表达载体pcambina1302-bnasap.a04，并通过农杆菌gv3101介导的遗传转化方法，将该重组子转化到westar油菜的下胚轴愈伤组织中，获得了阳性转基因植株。其研究证实，过表达甘蓝型油菜bnasap.a04基因能显著提高油菜种子的大小和重量。
4、mapk级联不仅在植物生长发育中发挥重要作用，而且在产生对生物和非生物胁迫的反应方面也起着重要作用。在过往研究中，bnampk3通过与芸苔油菜中的bnaarf2相互作用来促进器官大小，mapk4/5、mapk3/6(mpk3/6)、da1和泛素特异性蛋白酶15(ubp15)，被证实在er下游起作用并调节种子大小。osmkkk10-osmkk4-osmapk6信号通路被证实正向调节水稻的粒径和重量。以上研究均证明mapk级联反应与植株种子发育息息相关。
5、因此，研究mapk级联反应对种子大小的调控机制具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术对mapk级联反应对种子大小的调控机制展开了深入探索。本专利技术研究发现了一个调控种子大小的核心基因bnaa03.mkk6(bnaa03g0115500zs)。bnaa03.mkk6是甘蓝型油菜中mkk家族的一员。本专利技术通过构建bnaa03.mkk6的转基因材料并进行农艺性状考察，对其基本功能以及分子机制进行初步探究。本专利技术研究证实，bnaa03.mkk6可以调控甘蓝型油菜和/或拟南芥种子大小。本专利技术不仅完善了mapk级联反应调控种子发育的调控网络，更为甘蓝型油菜高质量分子育种提供了新思路。
2、有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种促进植物种子生长的bnaa03.mkk6基因，该基因可以调控种子大小。
3、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
4、促进植物种子生长的bnaa03.mkk6基因，所述bnaa03.mkk6基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述植物包括甘蓝型油菜和/或拟南芥。
5、进一步，所述bnaa03.mkk6基因的编码序列如seq id no:2所示。
6、进一步，所述bnaa03.mkk6基因编码氨基酸序列如seq id no:3所示的蛋白。
7、进一步，bnaa03.mkk6蛋白在细胞核与细胞膜上表达，具有组织表达特异性。
8、进一步，所述bnaa03.mkk6正调控植株种子大小和初生根伸长。
9、本专利技术的目的之二在于提供一种含有前述bnaa03.mkk6基因的过表达载体。
10、本专利技术的目的之三在于提供一种含有前述过表达载体的农杆菌。
11、本专利技术的目的之四在于提供一种获得高产、生长发育优良的甘蓝型油菜的方法。
12、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
13、获得高产、生长发育优良的甘蓝型油菜的方法，包括如下步骤：
14、(1)构建含有甘蓝型油菜bnaa03.mkk6基因的过表达载体；
15、(2)将步骤(1)所得过表达载体进行农杆菌转化，筛选转基因植株，即获得高产、生长发育优良的甘蓝型油菜。
16、进一步，步骤(1)具体包括：以甘蓝型油菜cdna为模板，采用引物p101-bnaa03.mkk6-f和p101-bnaa03.mkk6-r进行pcr扩增；将扩增的bnaa03.mkk6基因cdna重组到pentr/d-topo入门载体，转化大肠感受态dh5α；鉴定阳性克隆并测序检验，获得阳性质粒；将所得阳性质粒与pearleygate101表达载体进行lr反应，获得bnaa03.mkk6基因的过表达载体。
17、进一步，所述p101-bnaa03.mkk6-f的核苷酸序列如seq id no:4所示，所述p101-bnaa03.mkk6-r的核苷酸序列如seq id no:5所示。
18、本专利技术的目的之四在于提供一种前述bnaa03.mkk6基因、前述过表达载体和/或前述农杆菌在促进植物种子生长和初生根生长中的应用。
19、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
20、前述bnaa03.mkk6基因、前述过表达载体和/或前述农杆菌在促进植物种子生长和初生根生长中的应用，所述植物包括甘蓝型油菜和/或拟南芥。
21、本专利技术的目的之五在于提供一种前述bnaa03.mkk6基因、前述过表达载体和/或前述农杆菌在提高植物产量中的应用。
22、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
23、前述bnaa03.mkk6基因、前述过表达载体和/或前述农杆菌在提高植物产量中的应用，所述植物包括甘蓝型油菜和/或拟南芥。
24、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.促进植物种子生长的BnaA03.MKK6基因，其特征在于，所述BnaA03.MKK6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述植物包括甘蓝型油菜和/或拟南芥。
2.根据权利要求1所述的BnaA03.MKK6基因，其特征在于，所述BnaA03.MKK6基因的编码序列如SEQ ID NO:2所示；所述BnaA03.MKK6基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的蛋白。
3.含有权利要求1～2任一项所述的BnaA03.MKK6基因的过表达载体。
4.含有权利要求3所述的过表达载体的农杆菌。
5.获得高产、生长发育优良的甘蓝型油菜的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体包括：以甘蓝型油菜cDNA为模板进行PCR扩增；将扩增的BnaA03.MKK6基因cDNA重组到pENTR/D-TOPO入门载体，转化大肠感受态DH5α；鉴定阳性克隆并测序检验，获得阳性质粒；将所得阳性质粒与pEarleyGate101表达载体进行LR反应，获得BnaA03.MKK6基因的过表
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR扩增引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示的p101-BnaA03.MKK6-F和核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的p101-BnaA03.MKK6-R。
8.权利要求1～2任一项所述的BnaA03.MKK6基因、权利要求3所述的过表达载体和/或权利要求4所述的农杆菌在促进植物种子生长和初生根生长中的应用，其特征在于，所述植物包括甘蓝型油菜和/或拟南芥。
9.权利要求1～2任一项所述的BnaA03.MKK6基因、权利要求3所述的过表达载体和/或权利要求4所述的农杆菌在提高植物产量中的应用，其特征在于，所述植物包括甘蓝型油菜和/或拟南芥。
10.BnaA03.MKK6蛋白在通过与BnaC03.MPK4蛋白和/或BnaC03.MPK6蛋白互作从而调控植物种子大小和初生根生长中的应用，其特征在于，所述植物包括甘蓝型油菜和/或拟南芥；所述BnaA03.MKK6蛋白正向调控植物种子大小和初生根生长；所述BnaA03.MKK6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
...【技术特征摘要】
1.促进植物种子生长的bnaa03.mkk6基因，其特征在于，所述bnaa03.mkk6基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述植物包括甘蓝型油菜和/或拟南芥。
2.根据权利要求1所述的bnaa03.mkk6基因，其特征在于，所述bnaa03.mkk6基因的编码序列如seq id no:2所示；所述bnaa03.mkk6基因编码氨基酸序列如seq id no:3所示的蛋白。
3.含有权利要求1～2任一项所述的bnaa03.mkk6基因的过表达载体。
4.含有权利要求3所述的过表达载体的农杆菌。
5.获得高产、生长发育优良的甘蓝型油菜的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体包括：以甘蓝型油菜cdna为模板进行pcr扩增；将扩增的bnaa03.mkk6基因cdna重组到pentr/d-topo入门载体，转化大肠感受态dh5α；鉴定阳性克隆并测序检验，获得阳性质粒；将所得阳性质粒与pearleygate101表达载体进行lr反应，获得bnaa03.mkk6基因的过...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢坤，余世杰，魏丝雨，常玮，魏丽娟，曲存民，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
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