【技术实现步骤摘要】
本申请涉及病毒学、免疫学和生物医学的，尤其涉及一种人偏肺病毒f蛋白突变体及其应用。
技术介绍
1、人偏肺病毒（human metapneumovirus，hmpv）是一种呼吸道病毒，属于副粘病毒科，肺病毒亚科，偏肺病毒属，为单股负链rna病毒。目前，hmpv感染治疗主要是支持性的，尚无hmpv疫苗和特异性药物获得批准上市。国外有几款疫苗处于临床试验阶段，国内未见关于hmpv疫苗研发报道。鉴于hmpv在全球的广泛流行，并在幼儿、老年人和免疫功能缺陷人群中引发的严重症状，以及缺少对此病毒的预防。研发hmpv疫苗对于减轻疾病负担至关重要，特别是考虑到该病毒具有调节宿主免疫力的独特能力，因此在自然hmpv感染后，会形成较弱的适应性免疫，从而导致反复感染。
2、然而由于多种原因，传统的hmpv疫苗开发方法并不适用。有研究表明，在棉鼠模型中，使用福尔马林灭活的hmpv疫苗初免并加强免疫，然后用同源病毒攻击，与初次或继发感染组不同，接种疫苗组的间质性肺炎和肺泡炎水平升高或加重。因此，研发一种新型、安全、有效、能够提供长期保护的hmpv疫苗迫在眉睫。
3、hmpv分为a、b两种基因型，这两种基因型又进一步分为a1、a2、b1和b2四种亚型。其基因组长约13kb，编码9种蛋白。其中f蛋白对于膜融合是必需的，并且能够在没有吸附蛋白的参与下介导细胞融合，即hmpv的f蛋白既能够吸附细胞受体，又能够激活其介导的膜融合过程，具有吸附和融合的双重功能。f蛋白在诱导免疫保护、高水平血清和抗体中起重要作用。此外，hmpv f蛋白核苷酸序
4、因此，f蛋白诱导产生的保护性抗体，可抵抗不同亚型的感染。鉴于f蛋白的高免疫原性及其高度保守性，hmpv f蛋白成为候选疫苗的主要靶抗原。
技术实现思路
1、本申请提供一种人偏肺病毒f蛋白突变体及其应用。
2、本申请提供的人偏肺病毒f蛋白突变体具有稳定的融合前构象和高表达量，可形成稳定的三聚体，从而可用于hmpv疫苗开发。本申请提供的f蛋白突变体具有优良的免疫原性，配合ha201复合佐剂（qs-21+mpl脂质体）使用，可诱导优异的免疫反应。
3、第一方面，本申请提供一种人偏肺病毒f蛋白突变体，采用如下技术方案：
4、一种人偏肺病毒f蛋白突变体，所述人偏肺病毒f蛋白突变体为seq id no. 18-21中任意一项所述的氨基酸序列。
5、所述人偏肺病毒f蛋白突变体包含至少一种选自以下组的突变：
6、通过c-末端截短，实现可溶性表达；
7、通过c-末端串联三聚化结构域，提高三聚体稳定性；
8、通过添加c-末端标签，便于蛋白纯化；
9、通过点突变，稳定融合前构象；
10、通过酶切位点序列取代，提高f0酶切水解为f2和f1亚基的效率。
11、可选地，所述人偏肺病毒f蛋白突变体为seq id no. 18所述的氨基酸序列。
12、可选地，所述人偏肺病毒f蛋白突变体为seq id no. 19所述的氨基酸序列。
13、可选地，所述人偏肺病毒f蛋白突变体为seq id no. 20所述的氨基酸序列。
14、可选地，所述人偏肺病毒f蛋白突变体为seq id no. 21所述的氨基酸序列。
15、本申请提供了一种上述人偏肺病毒f蛋白突变体的制备方法，采用如下技术方案：
16、一种上述人偏肺病毒f蛋白突变体的制备方法，具体包括以下步骤：
17、s1在适合人偏肺病毒f蛋白表达的条件下培养如前所述的宿主细胞；
18、s2收集表达产物，并对表达产物进行纯化，得到人偏肺病毒f蛋白突变体。
19、进一步的，所述s1包括：
20、s11将含有人偏肺病毒f蛋白的基因克隆入表达载体中；
21、s12将s11所得的表达载体转化至基因工程化细胞中；
22、s13通过细胞池的筛选，获得稳定表达含有人偏肺病毒f蛋白的细胞株；
23、s14使用s13所得的细胞株进行表达，获得含有人偏肺病毒f蛋白的细胞培养上清。
24、进一步地。所述基因工程化细胞为cho细胞。
25、进一步地，所述表达载体为携带gs筛选系统和/或携带博莱霉素抗性基因的质粒表达载体。
26、第二方面，本申请提供一种基因。该基因表达上述人偏肺病毒f蛋白突变体。
27、第三方面，本申请提供一种表达载体。该表达载体包括上述基因。
28、第四方面，本申请提供一种宿主细胞。该宿主细胞表达上述基因或上述表达载体。
29、第五方面，本申请提供一种上述人偏肺病毒f蛋白突变体在制备用于预防hmpv感染的疫苗中的应用。
30、第六方面，本申请提供了一种预防hmpv感染的疫苗，采用如下技术方案：
31、一种预防hmpv感染的疫苗，所述疫苗包括上述人偏肺病毒f蛋白突变体，和药学上可可接受的载体或赋形剂。
32、本申请还提供了一种上述预防hmpv感染的疫苗的制备方法，采用如下技术方案：
33、一种预防hmpv感染的疫苗的制备方法，具体包括以下步骤：将纯化后的f蛋白与佐剂按比例单独包装或充分混匀。
34、进一步地，所述佐剂可以为佐剂系统ha201。
35、进一步地，所述佐剂系统ha201是一种脂质体混合物，本申请通过调整佐剂系统的配比和制备方法，得到了一种新型的佐剂系统。
36、本申请还提供了一种脂质体混合物的制备方法，采用如下技术方案：
37、一种脂质体混合物的制备方法，具体包括如下步骤：用异丙醇溶解3d-mla、dopc和胆固醇，经蒸发干燥形成脂质体膜后，加入pbs缓冲溶液水化，通过高压均质机均质至粒径达到90-110nm后加入qs-21，稀释后无菌过滤再分装即得。
38、综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
39、本申请通过对野生型hmpv f蛋白进行多种氨基酸的替代和缺失，获得了能够暴露更多中和抗体表位的hmpv融合前构象的f胞外域三聚体蛋白，在维持稳定的融合前构象的同时，确保了其可引起对hmpv的有效中和抗体反应和抗体结合反应。
40、此外，本申请使用hmpv融合前构象的f胞外域三聚体蛋白（人偏肺病毒f蛋白突变体）作为免疫原联合佐剂，相比hmpv postf蛋白获得了更强的免疫诱导效力，提高体液免疫应答和中和抗体产生，提升了hmpv抗原的免疫原性。
41、本申请公开的突变方式适用于人hmpv的其他病毒株；适用于以hmpv f蛋白为抗原的各种疫苗形式，如重组蛋白疫苗、核酸疫苗、病毒样颗粒疫苗和载体疫苗等。
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1. 一种人偏肺病毒F蛋白突变体，其特征在于，所述人偏肺病毒F蛋白突变体为SEQ IDNo. 18-21中任意一项所述的氨基酸序列。
2. 根据权利要求1所述的人偏肺病毒F蛋白突变体，其特征在于，所述人偏肺病毒F蛋白突变体为SEQ ID No. 18所述的氨基酸序列。
3. 根据权利要求1所述的人偏肺病毒F蛋白突变体，其特征在于，所述人偏肺病毒F蛋白突变体为SEQ ID No. 19所述的氨基酸序列。
4. 根据权利要求1所述的人偏肺病毒F蛋白突变体，其特征在于，所述人偏肺病毒F蛋白突变体为SEQ ID No. 20所述的氨基酸序列。
5. 根据权利要求1所述的人偏肺病毒F蛋白突变体，其特征在于，所述人偏肺病毒F蛋白突变体为SEQ ID No. 21所述的氨基酸序列。
6.一种基因，其特征在于，所述基因表达权利要求1所述的人偏肺病毒F蛋白突变体。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求6所述的基因。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞表达权利要求6所述的基因或权利要求7所述
9.一种权利要求1所述的人偏肺病毒F蛋白突变体在制备用于预防HMPV感染的疫苗中的应用。
10.一种预防HMPV感染的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1所述的人偏肺病毒F蛋白突变体，和药学上可接受的载体或赋形剂。
...【技术特征摘要】
1. 一种人偏肺病毒f蛋白突变体，其特征在于，所述人偏肺病毒f蛋白突变体为seq idno. 18-21中任意一项所述的氨基酸序列。
2. 根据权利要求1所述的人偏肺病毒f蛋白突变体，其特征在于，所述人偏肺病毒f蛋白突变体为seq id no. 18所述的氨基酸序列。
3. 根据权利要求1所述的人偏肺病毒f蛋白突变体，其特征在于，所述人偏肺病毒f蛋白突变体为seq id no. 19所述的氨基酸序列。
4. 根据权利要求1所述的人偏肺病毒f蛋白突变体，其特征在于，所述人偏肺病毒f蛋白突变体为seq id no. 20所述的氨基酸序列。
5. 根据权利要求1所述的人偏肺病毒...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓满，王海龙，王齐，董文娜，付丽丽，
申请(专利权)人：北京华诺泰生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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