【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于乳糖酶活性检测领域，具体涉及一种乳制品中乳糖酶活力的测定方法。
技术介绍
1、乳糖酶(lactase，ec 3.2.1.23)，又称β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，或称β-d-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-d-galactoside galatohydrolase)，简称onpg，是哺乳动物小肠黏膜微绒毛膜表面上存在的一种双糖酶。乳汁中的乳糖经乳糖酶水解，产物葡萄糖是人体各部分代谢的能量来源，半乳糖则是人大脑和黏膜组织代谢所必须的结构糖，是婴儿大脑发育的必要物质。当乳糖酶缺乏，乳糖不能被分解吸收，则会造成乳糖不耐受症及乳糖吸收不良，即乳糖酶缺乏症，检测乳糖酶活性是临床诊断乳糖酶缺乏症的常用手段。
2、乳糖酶主要用于乳品工业，可使低甜度和低溶解度的乳糖转变为较甜的、溶解度较大的单糖。使冰淇淋、浓缩乳、淡炼乳中乳糖结晶析出的可能性降低，同时增加甜度。因乳糖酶对生物体具有特殊重要性及催化活性，故其具有广阔的应用前景。
3、针对乳糖酶活性定量的检测方法，目前主要有小肠粘膜活检法、onpg试验法、稳定同位素法、高效液相色谱法(示差法)及粪便还原糖测定法。其中小肠粘膜活检法测乳糖酶活性主要是医学常用的方法，而小肠黏膜活检法是创伤性检查，操作具有一定的难度，受活检粘膜部位及操作者熟练程度等因素的影响；onpg实验法主要是通过邻硝基苯酚-β-d半乳糖苷在乳糖酶存在下，分解成半乳糖和邻硝基苯酚(简称onp)，邻硝基苯酚在420nm处有特异性吸收，通过分光光度计测定颜色深度，对样品澄清度要求较高，
4、基于此，本领域亟需一种乳制品中乳糖酶活力的分析方法，能够解决现有乳糖酶活力分析方法不适用于低乳糖酶活性乳制品的问题。
技术实现思路
1、鉴于上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种乳制品中乳糖酶活力的测定方法，能够解决现有乳糖酶活力分析方法无法分析低乳糖酶活性的乳制品的问题。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术提供了一种乳制品中乳糖酶活力的测定方法，包括以下步骤：
3、s1.将待测样品与邻硝基苯-β-d-半乳糖苷底物溶液混合反应，得到样品混合液，将混样品合液与反应终止液混合，离心后过滤得到样品待测液；
4、s2.将待测样品与反应终止液混合，得到空白混合液，将空白混合液与邻硝基苯-β-d-半乳糖苷底物溶液混合反应，离心后过滤得到空白待测液；
5、s3.配制梯度浓度的邻硝基苯酚标准工作溶液并进行hplc分析，根据分析结果绘制工作曲线；
6、s4.对样品待测液和空白待测液进行hplc分析，根据分析结果计算得到待测样品中乳糖酶活力，若待测样品中的邻硝基苯酚浓度超过工作曲线的线性范围，则需要对待测样品用缓冲液稀释后重复进行s1的步骤得到新的待测液，然后再对新的待测液进行分析，计算待测样品中乳糖酶活力；
7、待测样品中乳糖酶活力的计算公式如下：
8、
9、式中：
10、x—待测样品的酶活力，单位为u/g；
11、c—样品待测液中邻硝基苯酚的浓度，单位为毫克每升(mg/l)；
12、c0—空白待测液中邻硝基苯酚的浓度，单位为毫克每升(mg/l)；
13、v—待测样品定容体积，即待测样品体积、邻硝基苯-β-d-半乳糖苷底物溶液体积、反应终止液体积三者体积之和，单位为毫升(ml)，其中待测样品体积按照1g＝1ml换算；
14、m—样品待测液所代表样品的质量，单位为(g)；
15、m—邻硝基苯酚的摩尔质量：123.11g/mol；
16、t——反应时间(min)；
17、f——待测样品稀释倍数。
18、可选地，所述反应终止液为碳酸钠-edta水溶液或盐酸水溶液。
19、可选地，所述碳酸钠-edta水溶液中碳酸钠的浓度为40～60g/l。
20、可选地，所述盐酸水溶液的浓度为3～8mol/l。
21、可选地，所述β-d-半乳糖苷底物溶液中β-d-半乳糖苷的浓度为2.0～3.0g/l。
22、可选地，所述步骤s1中待测样品与邻硝基苯-β-d-半乳糖苷底物溶液的反应时间为5～15min。
23、可选地，所述步骤s2中待测样品与反应终止液的反应时间为5～15min。
24、可选地，所述步骤s1和步骤s2在25.0～35.0℃的环境下完成。
25、可选地，所述步骤s1和s2中待测样品与邻硝基苯-β-d-半乳糖苷底物溶液与反应终止液的质量体积比为(0.50～1.50)g：(2.50～7.50)ml：(1.00～3.00)ml。
26、可选地，所述步骤s1和s2中的待测样品和邻硝基苯-β-d-半乳糖苷底物溶液使用前需要在25～35℃的温度下平衡5～15min。
27、可选地，所述步骤s3中邻硝基苯酚梯度浓度标准溶液的浓度为0～200mg/l。
28、可选地，步骤s4中的hplc分析参数包括：
29、色谱柱：c18色谱柱，柱长250mm，内径4.6μm，填料粒径5μm；
30、柱温：35～45℃；
31、进样量：10μl；
32、检测器波长：275nm；
33、流动相：a：磷酸氢二铵缓冲液；b：甲醇；
34、流动相流速：0.5～1.5ml/min；
35、液相洗脱程序：
36、
37、
38、本专利技术的有益效果：
39、(1)本专利技术将高效液相色谱法和onpg底物法结合后规避了单独使用高效液相法不能分析低乳糖酶活性的缺陷，也避免了单独使用onpg法无法分析低乳糖酶活性的缺陷，同时还避使用分光光度法无法分析浑浊乳制品的缺陷，在处理乳制品基质中乳糖酶活力的测定优势明显，更加适用于乳制品测试。与现有标准中onpg试验法比较，本专利技术方法检出限能够达到6.5×10-2u/g，更加适合于低乳糖酶含量乳制品的检测。
40、(2)本专利技术使用液相色本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种乳制品中乳糖酶活力的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的乳制品中乳糖酶活力的测定方法，其特征在于，所述反应终止液为碳酸钠-EDTA水溶液或盐酸水溶液。
3.根据权利要求2所述的乳制品中乳糖酶活力的测定方法，其特征在于，所述碳酸钠-EDTA水溶液中碳酸钠的浓度为40～60g/L；
4.根据权利要求1所述的乳制品中乳糖酶活力的测定方法，其特征在于，所述β-D-半乳糖苷底物溶液中β-D-半乳糖苷的浓度为2.0～3.0g/L。
5.根据权利要求1所述的乳制品中乳糖酶活力的测定方法，其特征在于，所述步骤S1中待测样品与邻硝基苯-β-D-半乳糖苷底物溶液的反应时间为5～15min；
6.根据权利要求1所述的乳制品中乳糖酶活力的测定方法，其特征在于，所述步骤S1和步骤S2在25.0～35.0℃的环境下完成。
7.根据权利要求1所述的乳制品中乳糖酶活力的测定方法，其特征在于，所述步骤S1和S2中待测样品与邻硝基苯-β-D-半乳糖苷底物溶液与反应终止液的质量体积比为(0.50～1.50)g：(
8.根据权利要求1所述的乳制品中乳糖酶活力的测定方法，其特征在于，所述步骤S1和S2中的待测样品和邻硝基苯-β-D-半乳糖苷底物溶液使用前需要在25～35℃的温度下平衡5～15min。
9.根据权利要求1所述的乳制品中乳糖酶活力的测定方法，其特征在于，所述步骤S3中邻硝基苯酚梯度浓度标准溶液的浓度为0～200mg/L。
10.根据权利要求1所述的乳制品中乳糖酶活力的测定方法，其特征在于，所述步骤S4中的HPLC分析参数包括：
...【技术特征摘要】
1.一种乳制品中乳糖酶活力的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的乳制品中乳糖酶活力的测定方法，其特征在于，所述反应终止液为碳酸钠-edta水溶液或盐酸水溶液。
3.根据权利要求2所述的乳制品中乳糖酶活力的测定方法，其特征在于，所述碳酸钠-edta水溶液中碳酸钠的浓度为40～60g/l；
4.根据权利要求1所述的乳制品中乳糖酶活力的测定方法，其特征在于，所述β-d-半乳糖苷底物溶液中β-d-半乳糖苷的浓度为2.0～3.0g/l。
5.根据权利要求1所述的乳制品中乳糖酶活力的测定方法，其特征在于，所述步骤s1中待测样品与邻硝基苯-β-d-半乳糖苷底物溶液的反应时间为5～15min；
6.根据权利要求1所述的乳制品中乳糖酶活力的测定方法，其特征在于，所述步骤s1和步骤s...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，丛睿，王莎，赵华锋，苏萱，韩振伟，姚建华，姜伟，徐凯，王红梅，刘兴敏，
申请(专利权)人：青岛市华测检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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