【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，具体涉及一种检测土壤中腐烂茎线虫的引物、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、腐烂茎线虫（ ditylenchus destructor thorne），又称马铃薯腐烂茎线虫、甘薯腐烂茎线虫，是一种多食性植物寄生线虫，主要为害包括甘薯、马铃薯、当归和大蒜等块根、块茎、球茎和肉质植根作物。据报道，该线虫可以侵染120余种作物和杂草，取食70多种真菌，现已被列为全国农业植物检疫性有害生物。
2、腐烂茎线虫以卵、幼虫或成虫在土壤中度过不良环境。目前，通常采用浅盘法、贝尔曼漏斗法或蔗糖漂浮离心法等方法将土壤中的全部线虫分离出来，再依据形态学特征在显微镜下对其中的腐烂茎线虫进行鉴定和计数。鉴定过程繁琐且主要依赖操作者的经验，鉴定结果具有一定的主观性。随着分子生物学的发展，dna分子检测技术逐渐成为线虫检测最常用的手段。基于pcr检测技术，彭德良等（专利cn103740857a）开发了腐烂茎线虫pcr特异性检测引物；基于环介导恒温扩增技术，简恒等和徐春玲等开发了环介导等温技术扩增检测腐烂茎线虫的试剂盒（专利cn102260746a和cn107988383a）；基于重组重组酶聚合酶扩增技术，高波等和马居奎等开发了用于鉴定腐烂茎线虫的重组酶聚合酶扩增技术引物对及试剂盒（专利cn110863058a和cn111206106a）。然而这些技术都是检测土壤或样本中是否存在腐烂茎线虫，无法特异性预测土壤中腐烂茎线虫的含量，导致对腐烂茎线虫引起病害的预测预报面临巨大的难题。土
3、实时荧光定量pcr（taqman qpcr）技术是普通pcr定性基础上发展起来的一种核酸定量技术，不仅能对线虫进行定性研究，而且能够快速、准确、灵敏的定量线虫模板。通过直接提取土壤中的总dna，结合实时荧光定量pcr技术对土壤中的植物病原线虫进行定量检测，比传统形态学观察鉴定更为快捷和准确，该技术已在植物病原线虫的定量检测中得到广泛的应用。zhao等通过蔗糖漂浮离心法分离土壤中的线虫后，采用real-time pcr技术对南方根结线虫（ meloidogyne incognita）进行了定量检测（zhao y l, ruan w b, yu l,et al. combining max ratio analysis with real-time pcr and its potentialapplication for the prediction of meloidogyne incognita in field samples[j].journal of nematology, 2010, 42(2): 166.）；deych等通过real-time qpcr建立了茎线虫属三种重要线虫的定量检测技术（deych k o, pridannikov m v, nikitin m m, etal. simultaneous detection of three plant-parasitic nematode species from thegenus ditylenchus using a real-time qpcr matrix-based technology[j]. russianjournal of nematology, 2018, 26(2): 97-107.）。然而这些研究中，都是先通过分离线虫后，再对病原线虫定量检测，并不能检测到土壤中休眠的线虫和卵，往往会低估土壤中线虫的数量。
4、通过直接提取土壤中的dna，运用实时荧光定量pcr方法可以准确定量土壤中穿刺短体线虫（ pratylenchus penetran）的数量（sato e, suga y, kisaki c, et al.quantification of pratylenchus penetrans in radish fields using a combinationmethod of soil compaction and real-time pcr to determine the economicthreshold[j]. soil science and plant nutrition, 2011, 57(2): 213-220.）；min等通过直接提取土壤dna建立实时荧光定量pcr检测南方根结线虫的技术，并应用该技术对日本德岛县甘薯种植区进行线虫监测；watanabe等建立了南方根结线虫（ meloidogyne incognita）和北方根结线虫（ m. hapla）的real-time pcr检测技术，并应用该技术评估茄子产量损失与线虫初始密度之间相关性（watanabe t, masumura h, kioka y, et al.development of a direct quantitative detection method for meloidogyne incognita and m．hapla in andosol and analysis of relationship between theinitial population of meloidogyne spp. and yield of eggplant in an andosol[j]. nematological research (japanese journal of nematology), 2013, 43(2):21-29.）。jian等建立了基于taqman-mgb探针的实时荧光定量pcr方法，并成功应用于菲利普孢囊线虫（ heterodera filipjevi）的定量分析（jian j z, huang w k, kong l a, etal. molecular diagnosis and direct quantification of cereal cyst nematode( heterodera filipjevi) from field soil using taqman real-time pcr[j]. journalof integrative agriculture, 2023, 22(8): 2591-2601.）。前人大量研究实验表明直接提取土壤中dna并结合实时荧光定量pcr技术用于线虫病害预本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性检测腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor Thorne）的TaqMan qPCR引物和探针，其特征在于，包括核苷酸分别如SEQ ID NO: 1-3所示的上游引物、下游引物和探针；
2.根据权利要求1所述的TaqMan qPCR引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端包含有荧光基团，3’端包含淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的TaqMan qPCR引物和探针，其特征在于，所述探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ。
4.一种包含如权利要求1-3任一所述的特异性引物和探针的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性分子、聚合酶、底物和缓冲液中的至少一种。
6.一种检测腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor Thorne）的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，结果判定标准为：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，结果为阳性时，可根据线性方程计算样品中腐烂茎
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括制备标准曲线的步骤：
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的待检样品为土壤；
...【技术特征摘要】
1.一种特异性检测腐烂茎线虫（ditylenchus destructor thorne）的taqman qpcr引物和探针，其特征在于，包括核苷酸分别如seq id no: 1-3所示的上游引物、下游引物和探针；
2.根据权利要求1所述的taqman qpcr引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端包含有荧光基团，3’端包含淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的taqman qpcr引物和探针，其特征在于，所述探针的荧光基团为fam，淬灭基团为bhq。
4.一种包含如权利要求1-3任一所述的特异性引物和探针的试剂盒。
5.根据权利要求4所...
【专利技术属性】
技术研发人员：马居奎，唐伟，陈晶伟，孙厚俊，张成玲，杨冬静，高方园，梁昭，佟聪，
申请(专利权)人：江苏徐淮地区徐州农业科学研究所江苏徐州甘薯研究中心，
类型：发明
国别省市：
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