治疗组合物的制备制造技术

制品Ｒ－一种可用来治病毒感染并且刺激免疫系统的新治疗组合物包含一种具有３１个氨基酸的独特肽和另一种具有２１个氨基酸的独特肽，并且与寡核苷酸通过二磷酸二酯或二硫代二磷酸酯键合连接。所述组合物具有一种于２６０ｎｍ／２８０ｎｍ典型吸收比为１．９９８而于２６０ｎｍ／２３０ｎｍ典型吸收比为１．３５９的光吸收谱。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
1.专利
本专利技术涉及具有包含与寡核苷酸共价结合的多肽的结构并且可用作免疫调节剂的新型化合物，所述化合物可用来治疗各种病毒感染和免疫系统疾病。2.相关技术的描述由蛋白胨、肽、蛋白质和核酸组成的抗病毒剂的概念起源于1934。在经过若干年的实验之后，这样的抗病毒剂通过应用牛血清白蛋白并结合蛋白胨和核糖核酸而被修饰，产生无毒、无过敏原特性且容易与组织液和血清混合的抗病毒生物环境因子。所使用的因子被称为“脂肽-核酸化合物”1，由Chemico Laboratories，Inc.注册，商标为RETICULOSE(Physician Desk Reference，第651页，1960)。据报道RETICULOSE可作为抗病毒剂，用来治疗各种人类病毒感染，例如流感、疱疹、甲型肝炎和乙型肝炎。于是认为RETICULOSE至少通过增加白细胞生成、抗体合成和增强吞噬作用而作为抗病毒剂发挥作用。在美国最早于1964允许销售RETICULOSE。RETICULOSE的生产方法一直由生产商作为商业秘密而保密，直到美国专利5,849,196公布为止，所述专利公开了RETICULOSE的生产方法。正如在美国专利5,849,196中所公开的，用来生产RETICULOSE的原料按重量计由40-50％酪蛋白、1-10％血白蛋白、15-40％牛肉蛋白胨、10-25％RNA和5-25％氢氧化钠组成。将这些原料悬浮于水中，得到蛋白质(酪蛋白、蛋白胨和血白蛋白)与水的比率按重量计约等于4.3-100。在所述原料混合物经高压灭菌处理之后，将所得的溶液过滤，调pH至约8.5，然后至7.8，此后将中和溶液再次过滤。在将溶液稀释后，将pH进一步调至约7.5。这样的过程得到肽和核酸的混合物，其分子量在约1-25KDa的范围内。正如美国专利5,849,196所公开的，RETICULOSE常规组成中高于15KDa的组分在治疗诸如HIV、流感病毒、单纯疱疹病毒等的病毒性疾病时更加有效，而约1-15KDa范围内的组分可作为吞噬作用抑制剂发挥作用。然而，常规方法有多个缺点1)所述方法并不保证每次制备产生具有相同比率的终组分，从而产品是不可再现的；2)常规方法产生各种各样的终组分，如果可能的话，使得生产的质量控制变得极其困难，因为太多参数需要测定；3)高分子量组分例如25KDa组分(从本质上讲为肽)的存在，增加超敏反应或免疫反应的危险，使得产品稳定性较低。因此，最好具有避开常规RETICULOSE缺陷而同时保持其治疗特性的产品。最好从这样的产品也能鉴定并分离出有效成分或组分，以便可以进一步研究制品R的作用模式，从而可以开发出新的治疗药。专利技术概述因此，本专利技术的一个目的涉及从美国专利申请顺序号09/344,095中介绍的组合物—制品R中鉴定并分离的新型化合物。所述新型化合物具有包含与寡核苷酸共价结合的多肽的结构。本专利技术的另一个目的涉及一种表现出治疗效应的新型肽。本专利技术的再一个目的涉及这些新型核苷酸-肽和/或肽化合物的治疗应用，可用来治疗诸如病毒感染或免疫系统障碍的疾病。根据以下详述并结合附图考虑，本专利技术的其它目的和特征将变得显而易见。然而，应该知道设计的附图仅仅是为了说明本专利技术，而不是用来限制本专利技术，本专利技术仅受所附权利要求书的限制。还应该知道附图不一定是按照比例绘制，除非另有说明，它们仅仅用来概念性地说明本文中描述的结构和方法。附图简述在图中附图说明图1显示制品R的代表性紫外吸收分布图；图2显示从反相HPLC分析获得的制品R的代表性色谱图；图3显示制品R的BioGel P-2分级分离图；图4显示在16％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离的BioGel P-2分级分离图中级分I的组分；图5显示在16％SDS-PAGE上分离的制品R的两种主要肽组分的相对质量(Mr.)；图6是16％SDS-PAGE，显示各种各样的分解代谢酶对制品R的影响；图7是一幅流式细胞术频率分布图，显示制品R对葡聚糖-FITC吞噬作用的影响；图8是一幅流式细胞术频率分布图，显示制品R对葡聚糖-BoDipyFL吞噬作用的影响；图9是肽-A的质子NMR谱；图10是肽-A的碳/氢HSQC谱；图11是肽-B的质子NMR谱；图12是肽-B的磷-31 NMR谱；图13是肽-B的碳/氢HSQC谱；图14是肽-B的C-13 NMR谱；图15显示肽-B的结构；图16显示肽-B中丝氨酸18和二核苷酸之间的键合性质；图17显示与二核苷酸连接的肽的通用结构；图18是肽-B的质谱数据；图19显示制品R肽组分浓度对U937细胞分泌IL-8和MCP-1的影响；图20显示制品R的分离肽A和肽B对U937细胞分泌IL-8和MCP-1的影响。目前优选实施方案的详细描述制品R的制备一般而言，制品R依照以下方法来制备。首先，将原料酪蛋白、牛肉蛋白胨、RNA、BSA和氢氧化钠按比例按重量计为35-50％(酪蛋白)、15-40％(牛肉蛋白胨)、10-25％(RNA)、1-10％(BSA)和5-25％(氢氧化钠)悬浮于合适体积的蒸馏水中。所有原料都是可常规获得的，或者可以容易地由本领域技术人员制备。虽然任何RNA都适用于本专利技术的计划目的，但是优选植物RNA，最优选酵母RNA。总蛋白与蒸馏水量之比一般约1.5-2.5至约100(重量)，优选约2.2至约100(重量)。这意味着每次将1.5-2.5克总蛋白悬浮于约100毫升蒸馏水中。一般而言，所有原料或者是市售的，或者可以容易地由本领域技术人员制备。然后将如上制备的悬浮液在以下条件下高压灭菌在大约5-15lbs.、优选8-10lbs.的压力下，在例如约150-300°F、优选约200-230°F范围的升高温度下，在约2-10小时的时间内、优选超过3小时。正如本领域技术人员已知的，在这样的条件下，RNA可以完全水解成核苷酸。高压灭菌后，让溶液冷却至室温，然后让其在3-8℃的温度下静置至少12小时，以沉淀不溶性成分。或者，可以将冷却溶液在低于8℃的温度下离心，以除去沉淀。然后使所得的溶液在诸如氮气或氩气的惰性气体、在约1-6psi的压力下通过2微米和0.45微米滤器过滤。以相似的方式，使溶液通过优选0.2微米致热原保留滤器再次过滤。在上述过滤后，可以再让溶液冷却至3-8℃达至少约12小时，然后以与如上所述相同的方式再次过滤。然后采用本领域技术人员已知的方法，例如Kjeldahl方法，J.G.C.D.Kjeldahl，Z.Anal.Chem.，第22卷，第366页(1883)及其改进方法，分析所得滤液的总氮含量。根据所述分析，然后将滤液用冷蒸馏水稀释至具有优选总氮含量在165-210mg/ml范围内的合适体积。然后用HCl将稀释溶液的pH调节至生理上可接受的pH，优选至约7.3-7.6，此后，使稀释溶液在如上所述的惰性气体下通过0.2微米滤器再次过滤。如此生产的制品R基本上含有来自RNA完全水解的低分子量核苷酸、核苷和游离核酸碱基及来自蛋白质部分水解的小肽。此外蛋白质的碱水解产生游离氨基酸也是可能的。不用说过滤技术的应用可基本上除去细菌或者其大小与细菌相似或比细菌大的其它颗粒。因此，任何滤器无论其生产商或由其制得的材料都适用于计划目的。本专利技术方法中所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＳＥＱＩＤＮＯ：１肽。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：B弗里兰德，SZ希尔施曼，IB塔拉波雷瓦拉，
申请(专利权)人：先进病毒研究公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]