【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于固定化微生物技术和微生物环境修复，具体涉及一种壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂及其制备方法与应用。
技术介绍
1、目前，固定化微生物技术在污染土壤修复领域的应用，特别是对石油污染土壤修复的研究，已引起环保工作者的广泛关注。石油污染土壤微生物修复技术的核心在于微生物对污染物的降解作用，而如何高效发挥这一降解作用，是成功实现石油污染土壤生物修复的关键所在。直接向污染土壤中添加游离微生物，往往会使微生物难以适应复杂的土壤环境，还会与土著微生物构成竞争关系，导致微生物活性难以保障，降解能力大打折扣。固定化微生物技术则通过将游离微生物固定在特定载体上，使其高度密集并保持活性，在适宜条件下能够快速、大量增殖。
2、生物炭凭借比表面积大、孔隙发达、有机质含量高等优势，成为固定化微生物技术的常用载体之一。然而，直接使用生物炭固定化微生物时，存在微生物生物活性低、负载量低以及微生物附着不牢固等问题，严重限制了生物炭在固定化微生物载体中的应用效果和稳定性。因此，对生物炭进行改性成为该领域的研究热点。
3、壳聚糖是一种天然聚合物，无毒无污染，具有良好的生物相容性、生物降解性和生物活性等特点，被广泛应用于生物工程、医药、化工、食品、环保等领域，因其环保和生态友好性也使其应用研究具有广阔前景与意义。利用壳聚糖对生物炭进行改性，解决活性炭载体的缺陷，以期获得性能更好的微生物载体。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提出一种壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂，该壳聚
2、本专利技术的技术方案为，一种壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂的制备方法，步骤包括：
3、(1)将复合菌液、保护剂与生物炭混合后，2-8℃保存，制备生物炭固定化复合菌剂；
4、(2)将生物炭固定化复合菌剂加入壳聚糖乙酸溶液混匀，再加入碱调节ph为7，冷冻干燥，即得壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂。
5、步骤(1)中，复合菌液同保护剂与生物炭混合前，先进行离心处理，离心速度为4000-5000r/min，优选为4000r/min。
6、步骤(1)中，复合菌液为od600＝1.0-1.2的tb1菌液与od600＝1.0-1.2的tx3菌液按照体积比0.5-2:1进行混合制得，优选的，tb1菌液与tx3菌液的体积比为2:1，tb1菌液与tx3菌液的od600＝1.0。
7、所述tb1菌液的制备包括：tb1接种至培养基中，37℃、150r/min恒温振荡培养后，离心，用无菌生理盐水重悬至od600＝1.0。恒温振荡培养的时间为10-14小时，确保菌株处于最佳活性状态。用无菌生理盐水重悬前，先采用无菌生理盐水清洗2-3遍。
8、所述tx3菌液的制备包括：tx3接种至培养基中，37℃、150r/min恒温振荡培养后，离心，用无菌生理盐水重悬至od600＝1.0。恒温振荡培养的时间为10-14小时，优选为12小时，确保菌株处于最佳活性状态。用无菌生理盐水重悬前，先采用无菌生理盐水清洗2-3遍。
9、所述培养基为胰蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、氯化钠10.0g、蒸馏水1l。
10、步骤(1)中，生物炭与复合菌液的用量比为0.5-3g:500ml，优选为1g:500ml；保护剂与复合菌液的体积比为0.5-2:150，优选为1:150；所述保护剂为甘油，优选为50％(v/v)甘油。
11、步骤(1)中，所述生物炭的粒径为0.15-0.425mm，所述生物炭的制备包括：将生物质原料于500℃-600℃炭化温度下进行烧制。烧制产物再进行研磨，过40目-100目尼龙筛，制备粒径0.15-0.425mm的生物炭。生物炭该粒径范围有助于微生物更好地附着，同时保留生物炭优良特性，为后续固定化提供理想载体。
12、步骤(1)中，2-8℃保存过夜，优选4℃保存过夜。保证菌液的稳定性与菌株的活性。
13、通过精准调控步骤(1)的上述各培养条件以及使用保护剂，极大地提高了复合菌群的活性和稳定性。
14、步骤(2)中，生物炭固定化复合菌剂与壳聚糖的质量为0.5-1.5:1，优选为0.75:1；壳聚糖乙酸溶液中壳聚糖的浓度为0.03-0.05g/ml，优选为0.04g/ml；所述壳聚糖为脱乙酰度＞90％、粘度＜100mpa·s的壳聚糖，乙酸浓度为5％(v/v)。
15、所述壳聚糖乙酸溶液的制备包括：将壳聚糖缓慢溶于乙酸溶液中。壳聚糖乙酸溶液中壳聚糖的浓度为0.03-0.05g/ml，优选为0.04g/ml；所述壳聚糖为脱乙酰度＞90％、粘度＜100mpa·s的壳聚糖，所述乙酸溶液浓度为5％(v/v)。
16、步骤(2)中，所述碱为无机碱和/或有机碱，无机碱包括但不限于碳酸盐、碳酸氢盐、氢氧化物、磷酸盐、磷酸氢盐等，如碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸钠、磷酸氢钠、磷酸氢钾等，优选为氢氧化钠或氢氧化钾，更优选为10％(w/v,g/ml)的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。所述有机碱包括但不限于醚基钠、醚基钾、乙醇钠、乙醇钾、乙酸钠、乙酸钾、乙酰胺钠等。
17、步骤(2)中，缓慢加入碱调节ph为7，引发壳聚糖在生物炭表面成膜。
18、本专利技术还提供由上述壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂的制备方法制备的壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂，包含复合菌、生物炭与壳聚糖，复合菌固定附着于生物炭的表面及孔隙内部，壳聚糖在生物炭表面形成一层均匀的膜结构。
19、所述复合菌包括tb1与tx3，为od600＝1.0-1.2的tb1菌液与od600＝1.0-1.2的tx3菌液按照体积比0.5-2:1进行混合制得，优选的，tb1菌液与tx3菌液的体积比为2:1，tb1菌液与tx3菌液的od600＝1.0。优选地，tb1菌液与tx3菌液混合后进行离心处理，离心速度为4000-5000r/min，优选为4000r/min。
20、本专利技术由上述壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂的制备方法制备的壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂，固菌量＞1011cfu/g，保存70d后固菌量仍>1010cfu/g，显著提升固定化微生物的活菌数和稳定性；对苯并[a]芘降解率高达67.01％，对柴油降解率高达73.67％，显著提升对多环芳烃与石油烃复合污染的污染物的降解率；在ph4-10以及4-40g/l盐浓度的范围内均有降解活性，在中性至弱碱性环境ph6-9以及8-25g/l盐浓度范围内，保持更好的降解活性，展现出良好的环境适应性。
21、本专利技术上述提供的壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂用于制备应用于多环芳烃和/或石油烃的产品，该产品对多环芳烃和/或石油烃具有降解活性，对多环芳烃和本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂的制备方法，其特征在于，步骤包括：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，复合菌液同保护剂与生物炭混合前，先进行离心处理。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，生物炭与复合菌液的用量比为0.5-3g:500mL，保护剂与复合菌液的体积比为0.5-2:150，复合菌液为OD600＝1.0-1.2的TB1菌液与OD600＝1.0-1.2的TX3菌液按照体积比0.5-2:1进行混合制得。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，生物炭固定化复合菌剂与壳聚糖的质量为0.5-1.5:1，壳聚糖乙酸溶液中壳聚糖的浓度为0.03-0.05g/mL。
5.一种由权利要求1-4中任一项制备方法制备的壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂，其特征在于，包含复合菌、生物炭与壳聚糖，复合菌固定附着于生物炭的表面及孔隙内部，壳聚糖在生物炭表面形成一层均匀的膜结构。
6.根据权利要求5所述的壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂，其特征在于，所述复合菌包括T
7.权利要求1-4中任一项制备方法制备的壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂或权利要求5或6所述的壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂用于制备应用于多环芳烃和/或石油烃的产品。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品适用于土壤或水体，对多环芳烃和/或石油烃具有降解活性，和/或对多环芳烃和/或石油烃造成的污染具有修复活性和/或改良活性。
9.一种应用于多环芳烃和/或石油烃的产品，其特征在于，含有权利要求1-4中任一项制备方法制备的壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂或权利要求5或6所述的壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述产品适用于土壤或水体，对多环芳烃和/或石油烃具有降解活性，和/或对多环芳烃和/或石油烃造成的污染具有修复活性和/或改良活性。
...【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂的制备方法，其特征在于，步骤包括：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，复合菌液同保护剂与生物炭混合前，先进行离心处理。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，生物炭与复合菌液的用量比为0.5-3g:500ml，保护剂与复合菌液的体积比为0.5-2:150，复合菌液为od600＝1.0-1.2的tb1菌液与od600＝1.0-1.2的tx3菌液按照体积比0.5-2:1进行混合制得。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，生物炭固定化复合菌剂与壳聚糖的质量为0.5-1.5:1，壳聚糖乙酸溶液中壳聚糖的浓度为0.03-0.05g/ml。
5.一种由权利要求1-4中任一项制备方法制备的壳聚糖改性生物炭固定化复合菌剂，其特征在于，包含复合菌、生物炭与壳聚糖，复合菌固定附着于生物炭的表面及孔隙内部，壳聚糖在生物炭表面...
【专利技术属性】
技术研发人员：李法云，郭琴，马佚铭，李晓桐，周纯亮，戴佩娜，
申请(专利权)人：上海应用技术大学，
类型：发明
国别省市：
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