【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学高通量实验，具体涉及一种高效的植物组蛋白或转录因子及其结合dna的分离方法，适用于chip-seq样品制备。
技术介绍
1、高通量测序技术如chip-seq（chromatin immunoprecipitation sequencing）在揭示基因组调控机制中发挥了关键作用。然而，对于植物组织样品的chip-seq分析，例如针对组蛋白修饰h3k4me3或者转录因子的研究，面临着技术上的挑战和限制。传统方法对目的蛋白和dna复合物的富集程度有限，往往伴随较多杂蛋白干扰，导致信噪比偏低。
2、如申请公布号为cn 118109571 a的专利技术专利申请，公开了一种适于植物应用的转录因子chip-seq方法，包括如下步骤：(1)叶片材料固定；(2)细胞核提取及dna打断（采用核裂解缓冲液进行dna打断）；(3)dna共沉淀（使用标签抗体与打断后的dna片段进行免疫共沉淀反应）；(4)tn5酶反应；(5)解交联反应。该方法虽然实现了chip-seq技术在植物叶片中的应用，但该方法测序结果信噪比高，测序数据质量有限。
3、因此，开发一种适用于植物组织的富集dna和目标蛋白复合物的chip-seq方法变得至关重要，以便能够在样品中高精度地检测和定量目标蛋白如组蛋白修饰或者转录因子结合位点的分布情况。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术中的chip-seq技术易富集杂蛋白且信噪比高的问题，提供一种基于染色质预富集的高效植物chipmenta
2、本专利技术可通过以下技术方案来实现：
3、一种基于染色质预富集的高效植物chipmentation方法，包括：
4、首先将植物组织样本进行甲醛交联，然后提取植物组织的细胞核，接着超声片段化dna，沉淀dna-目标蛋白复合物，再用小体积低盐溶液溶解沉淀，使用特异性目标蛋白抗体将dna-目标蛋白复合物固定在磁珠上，利用tn5转座酶片段化dna并在片段化后的dna两端添加测序接头，再通过解交联从磁珠上释放dna，进行dna纯化后构建测序文库并完成测序。
5、具体步骤如下：
6、（1）植物组织样本的甲醛交联：
7、本步骤的目的是使植物组织中的蛋白质（如组蛋白或转录因子）和dna之间形成可逆的共价键。具体操作为：
8、取植物组织浸没于含1%w/v 甲醛的交联缓冲液中，抽真空。加入终止交联缓冲液，抽真空。本步骤中交联缓冲液和终止缓冲液将植物组织浸没即可。
9、所述交联缓冲液的溶质组成为：1×pbs、1%w/v多聚甲醛、1微摩尔每毫升pmsf，用无菌去离子水溶解定容；其中，pmsf用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，dmso）提前助溶。
10、所述终止交联缓冲液的溶质组成为：500微摩尔每毫升甘氨酸和500微摩尔每毫升ph 7.5的tris-hcl，用无菌去离子水溶解定容。
11、（2）植物组织的细胞核提取：
12、将甲醛交联后的植物组织样本进行研磨，然后加入细胞核提取液，0℃条件下提取细胞核；然后过100微米细胞筛、40微米细胞筛，以除去细胞核以外的细胞碎片，接着用细胞核提取液清洗直至细胞核沉淀呈灰白色。其中，每0.2克植物组织加入10毫升细胞核提取液。
13、所述细胞核提取液的溶质组成为：0.6摩尔每升山梨醇、10微摩尔每毫升ph 8.0的tris-hcl、1微摩尔每毫升edta、0.5% v/v triton x-100和1微摩尔每毫升pmsf，用无菌去离子水溶解定容；其中，pmsf用二甲基亚砜提前助溶。
14、（3）超声片段化dna：
15、将步骤（2）所得细胞核沉淀重悬于超声缓冲液中后，进行超声，以片段化dna。向超声后的溶液中加入中盐缓冲液溶解dna，得dna溶液，并用磁珠对dna溶液进行预清洁。
16、所述超声缓冲液的溶质组成为：10微摩尔每毫升ph 8.0的tris-hcl、1微摩尔每毫升edta、0.15%w/v 十二烷基硫酸钠（sds）、1×蛋白酶抑制剂和1微摩尔每毫升pmsf，用无菌去离子水溶解定容；其中，pmsf用二甲基亚砜提前助溶。其中所用的蛋白酶抑制剂为广谱蛋白酶抑制剂，采用的是市售产品；所用的pmsf为针对丝氨酸蛋白酶的抑制剂；两种蛋白酶抑制剂共同使用可增强蛋白酶抑制效果。
17、所述中盐缓冲液的溶质组成为：300微摩尔每毫升nacl、2% v/v triton x-100、1×蛋白酶抑制剂、10微摩尔每毫升ph 8.0的tris-hcl和1微摩尔每毫升edta，用无菌去离子水溶解定容。
18、（4）沉淀dna-目标蛋白复合物：
19、向步骤（3）得到的dna溶液中加入糖原、醋酸钠和预冷乙醇，-20℃下静置以沉淀dna-目标蛋白复合物，离心后用低盐溶液溶解沉淀，去杂后得dna-目标蛋白复合物溶液。所述预冷乙醇是将无水乙醇在-20℃下放置20分钟。作为一种实施方式，所述糖原的浓度为20毫克/毫升，醋酸钠的浓度为0.3微摩尔每毫升，糖原、醋酸钠和预冷乙醇的体积比为1:50:1500。
20、其中，每1克植物组织得到的dna-目标蛋白复合物沉淀采用125微升的低盐溶液进行溶解。
21、所述低盐溶液的溶质组成为：150微摩尔每毫升nacl、0.1% v/v triton x-100、1×蛋白酶抑制剂、10微摩尔每毫升ph 8.0的tris-hcl和1微摩尔每毫升edta，用无菌去离子水溶解定容。其中所用的蛋白酶抑制剂为广谱蛋白酶抑制剂，采用的是市售产品。
22、（5）磁珠与特异性目标蛋白抗体、目标蛋白结合：
23、将磁珠用低盐溶液进行清洗重悬后加入特异性目标蛋白抗体，孵育。然后与步骤（4）得到的dna-目标蛋白复合物溶液混合，孵育。接着对孵育后的磁珠用低盐溶液、高盐溶液、吐温溶液依次进行清洗。
24、所述低盐溶液的组成同步骤（4）；
25、所述高盐溶液的溶质组成为：0.5摩尔每升nacl、10微摩尔每毫升ph 8.0的tris-hcl、1微摩尔每毫升edta、0.5% v/v triton x-100、0.5% doc、1微摩尔每毫升pmsf，用无菌去离子水溶解定容；其中，pmsf用二甲基亚砜提前助溶。
26、所述吐温溶液的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于染色质预富集的高效植物ChIPmentation方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的一种基于染色质预富集的高效植物ChIPmentation方法，其特征在于，所述将植物组织样本进行甲醛交联，包括：取植物组织浸没于含甲醛的交联缓冲液中，抽真空；加入终止交联缓冲液，抽真空。
3.根据权利要求1所述的一种基于染色质预富集的高效植物ChIPmentation方法，其特征在于，所述提取植物组织的细胞核，包括：将甲醛交联后的植物组织样本进行研磨，然后加入细胞核提取液，0℃条件下提取细胞核；去除细胞碎片，用细胞核提取液清洗样品直至细胞核沉淀为灰白色。
4.根据权利要求1所述的一种基于染色质预富集的高效植物ChIPmentation方法，其特征在于，超声片段化DNA时，是将超声缓冲液加到细胞核沉淀中后再进行超声；
5.根据权利要求1所述的一种基于染色质预富集的高效植物ChIPmentation方法，其特征在于，所述超声片段化DNA后，还包括，用中盐缓冲液溶解DNA，并用磁珠对得到的DNA溶液进行预清洁；
6.根
7.根据权利要求1所述的一种基于染色质预富集的高效植物ChIPmentation方法，其特征在于，所述使用特异性目标蛋白抗体将DNA-目标蛋白复合物固定在磁珠上，包括：将磁珠用低盐溶液进行清洗重悬后加入特异性目标蛋白抗体，孵育；然后与DNA-目标蛋白复合物溶液混合，孵育；对孵育后的磁珠进行清洗。
8.根据权利要求7所述的一种基于染色质预富集的高效植物ChIPmentation方法，其特征在于，所述对孵育后的磁珠进行清洗包括：用低盐溶液、高盐溶液、吐温溶液依次进行清洗；
9.根据权利要求1所述的一种基于染色质预富集的高效植物ChIPmentation方法，其特征在于，所述利用Tn5转座酶片段化DNA并在片段化后的DNA两端添加测序接头，包括：用Tn5缓冲液清洗、重悬磁珠，加入Tn5转座酶和测序接头，混匀，孵育，洗涤磁珠；
10.根据权利要求1所述的一种基于染色质预富集的高效植物ChIPmentation方法，其特征在于，所述解交联包括：向磁珠中加入解交联缓冲液进行解交联，解交联条件为：55℃孵育30分钟，63℃孵育4小时；
...【技术特征摘要】
1.一种基于染色质预富集的高效植物chipmentation方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的一种基于染色质预富集的高效植物chipmentation方法，其特征在于，所述将植物组织样本进行甲醛交联，包括：取植物组织浸没于含甲醛的交联缓冲液中，抽真空；加入终止交联缓冲液，抽真空。
3.根据权利要求1所述的一种基于染色质预富集的高效植物chipmentation方法，其特征在于，所述提取植物组织的细胞核，包括：将甲醛交联后的植物组织样本进行研磨，然后加入细胞核提取液，0℃条件下提取细胞核；去除细胞碎片，用细胞核提取液清洗样品直至细胞核沉淀为灰白色。
4.根据权利要求1所述的一种基于染色质预富集的高效植物chipmentation方法，其特征在于，超声片段化dna时，是将超声缓冲液加到细胞核沉淀中后再进行超声；
5.根据权利要求1所述的一种基于染色质预富集的高效植物chipmentation方法，其特征在于，所述超声片段化dna后，还包括，用中盐缓冲液溶解dna，并用磁珠对得到的dna溶液进行预清洁；
6.根据权利要求1所述的一种基于染色质预富集的高效植物chipmentation方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：涂晓雨，李杨美汇，张优，李传顺，龙正标，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
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