【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑载体，尤其涉及带有色素报告基因表达盒的植物多基因编辑载体及其在对植物基因进行编辑或过表达外源基因中的应用，属于带有色素报告基因表达盒的可视化基因编辑载体及其应用领域。
技术介绍
1、crispr/cas9基因组编辑技术，因其简单，灵活，高效，易操作，成为作物功能基因组研究和遗传改良的理想工具，而多个靶点sgrna的串联组装，既可以提高单基因编辑效率，还可以同时编辑多个基因用于基因家族分析、信号通路或代谢途径研究以及复杂农艺性状解析。
2、紫花苜蓿(medicago sativa)是世界范围内广泛种植的豆科苜蓿属多年生牧草，具有高产，优质和广适性，具有很高的经济和生态价值。因此，紫花苜蓿遗传育种工作具有重要意义。但是，紫花苜蓿栽培种多为自交不亲和、异花授粉的同源四倍体，基因组高度杂合，导致紫花苜蓿的基础研究和育种工作进展缓慢，因此亟需建立高效的紫花苜蓿编辑系统。已报道的紫花苜蓿基因编辑体系，存在t0代获得突变体的效率较低或只能设计双靶点等问题，需要进一步优化和改进。此外，不同的sgrna对靶位点的编辑效率会有很大差异，有效sgrna的筛选很有必要。相比周期长和转化效率低的稳定遗传转化，发根系统更加简单快速高效，常被用来评价编辑体系和sgrna的效率。目前紫花苜蓿中缺少简单高效稳定的发根系统，尤其是用来评价编辑体系和sgrna，更需要简单精准的筛选转基因阳性材料。
3、可视化报告基因常被应用于遗传转化，快速精准区分转基因事件。相比传统的荧光蛋白和β-葡萄糖苷酸酶(gus)，色素报告系统产
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一是提供rh1基因作为植物遗传转化色素报告基因的用途；
2、本专利技术的目的之二是提供一种色素报告基因表达盒的一种可视化植物多基因编辑载体；
3、本专利技术的目的之三是将所述的可视化植物多基因编辑载体应用于植物多基因编辑或多基因过表达等方面。
4、为实现上述目的，本专利技术所采取的主要的技术方案包括：
5、本专利技术的一方面是提供了rh1基因作为植物遗传转化色素报告基因的用途；本专利技术发现，rh1基因调控合成的花青素作为报告分子，其在自然光下肉眼可见，能够简单快速的指示植物转基因的发生与否，由此能够将rh1基因作为植物遗传转化色素报告基因；譬如，构建用rh1基因作为色素报告基因的表达盒，将该表达盒插入到植物遗传转化载体中得到含有色素报告基因表达盒的植物遗传转化载体；其中，所述的植物遗传转化载体可以是植物基因过表达载体，也是可以植物基因编辑载体；所述的含有色素报告基因表达盒由启动子、rh1基因和终止子可操作的连接得到；所述的启动子可以根据植物遗传转化载体构建的要求，采用不同类型的启动子，诸如是不同表达强度的启动子或组织特异性表达的启动子等。
6、另外，还可以在所述的rh1基因表达盒中预留一个或多个供外源基因插入的酶切位点。
7、本专利技术的另一方面是提供了一种含有色素报告基因表达盒的可视化植物多基因编辑载体，包括：包括sgrna表达盒和cas9表达盒，所述的sgrna表达盒为2个或2个以上且sgrna表达盒串联在一起；每个sgrna表达盒的组成元件包括紫花苜蓿内源u6启动子、靶向植物基因的靶标序列sgrna和终止子；所述靶向植物基因的靶标序列sgrna的数量为2个或2个以上且采用trna将每个靶标序列sgrna串联在一起，其中，所述植物多基因编辑载体中插入色素报告基因表达盒。
8、本专利技术的一种优选的具体实施方案，在所述植物多基因编辑载体的pmei酶切位点处插入色素报告基因表达盒。
9、本专利技术的一种优选的具体实施方案，所述的色素报告基因表达盒包括：启动子，色素报告基因和终止子；其中，所述的启动子是cmylcv启动子，所述的cmylcv启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述的终止子是athspt终止子，所述的athspt终止子的核苷酸序列如seq id no.3所示。
10、本专利技术的一种优选的具体实施方案，所述的色素报告基因是rh1基因或ruby基因；其中，所述的rh1基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述的ruby基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
11、本专利技术的一种优选的具体实施方案，在色素报告基因表达盒中含有供一个或多个供外源基因插入或替换的一个或多个酶切位点；譬如，所述的酶切位点可以是kpni或bsrgi(pmei-pcmylcv-kpni-rh1/ruby-bsrgi-athspt)。
12、本专利技术的一种优选的具体实施方案，所述的sgrna表达盒的数量为3个；每个sgrna表达盒中的靶向植物基因的靶标序列sgrna的数量为3个；其中，每个sgrna表达盒中的靶向植物基因的靶标序列sgrna是靶向植物的不同基因或靶向植物的相同基因；优选的，每个sgrna表达盒中的靶向植物基因的靶标序列sgrna是靶向紫花苜宿基因组的不同基因或相同基因；更优选的，每个sgrna表达盒中的靶向植物基因的靶标序列sgrna分别靶向紫花苜蓿基因组中的mstfl1c基因、靶向紫花苜蓿基因组中的mstfl1a基因或靶向紫花苜蓿基因组中的mstfl1b基因。
13、本专利技术的一种优选的具体实施方案，所述的紫花苜蓿内源u6启动子选自mtu6-d1启动子、msu6-g1启动子或msu6-d3启动子；
14、所述的采用trna将每个靶标序列sgrna串联在一起的方式包括：每个靶标序列sgrna的5＇端连接一个trna，靶标序列sgrna的3＇端连接一个sgrna scaffold；
15、所述的终止子为atu6-26t终止子；在每个sgrna表达盒中的启动子序列之后连接有转录起始位点g。
16、本专利技术的一种优选的具体实施方案，所述的植物是豆科植物；优选的，所述的豆科植物是苜蓿；更优选的，所述的苜蓿是紫花苜蓿。
17、本专利技术的另一方面是将所述的可视化植物多基因编辑载体应用于植物多基因编辑或植物多基因过表达等方面。
18、本专利技术的一种优选的具体实施方案，可视化植物多基因编辑载体应用于对植物靶基因的编辑，包括：(1)根据植物的靶基因设计多个靶点的sgrn本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.RH1基因作为植物遗传转化色素报告基因的用途；所述的RH1基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
2.一种含有色素报告基因表达盒的植物遗传转化载体，其特征在于，所述的色素报告基因是RH1基因；所述的RH1基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.2所示。
3.一种可视化植物多基因编辑载体，包括sgRNA表达盒和Cas9表达盒，所述的sgRNA表达盒为2个或2个以上且sgRNA表达盒串联在一起；每个sgRNA表达盒的组成元件包括紫花苜蓿内源U6启动子、靶向植物基因的靶标序列sgRNA和终止子；所述靶向植物基因的靶标序列sgRNA的数量为2个或2个以上且采用tRNA将每个靶标序列sgRNA串联在一起；其特征在于，所述植物多基因编辑载体中插入色素报告基因表达盒。
4.根据权利要求3所述的可视化植物多基因编辑载体，其特征在于，在所述植物多基因编辑载体的PmeI酶切位点处插入色素报告基因表达盒。
5.根据权利要求4所述的可视化植物多基因编辑载体，其特征在于，所述的色素报告基因表达盒包括：启动子，色素报告基因和终止子，其中，所述的色素报告
6.根据权利要求3或4所述的可视化植物多基因编辑载体，其特征在于，所述色素报告基因表达盒中含有供一个或多个供外源基因插入或替换的一个或多个酶切位点；其中，所述的酶切位点是KpnI或BsrGI。
7.根据权利要求3所述的可视化植物多基因编辑载体，其特征在于，所述的sgRNA表达盒的数量为3个；每个sgRNA表达盒中的靶向植物基因的靶标序列sgRNA的数量为3个；其中，每个sgRNA表达盒中的靶向植物基因的靶标序列sgRNA是靶向植物的不同基因或靶向植物的相同基因；优选的，每个sgRNA表达盒中的靶向植物基因的靶标序列sgRNA是靶向紫花苜宿基因组的不同基因或相同基因；更优选的，每个sgRNA表达盒中的靶向植物基因的靶标序列sgRNA分别靶向紫花苜蓿基因组中的MsTFL1c基因、靶向紫花苜蓿基因组中的MsTFL1a基因或靶向紫花苜蓿基因组中的MsTFL1b基因。
8.根据权利要求3所述的可视化植物多基因编辑载体，其特征在于，所述的紫花苜蓿内源U6启动子选自MtU6-d1启动子、MsU6-g1启动子或MsU6-d3启动子；
9.根据权利要求3所述的可视化植物多基因编辑载体，其特征在于，所述的植物是豆科植物；优选的，所述的豆科植物是苜蓿；更优选的，所述的苜蓿是紫花苜蓿。
10.权利要求3-5任何一项所述的可视化植物多基因编辑载体在对植物中多个基因进行编辑或在植物中表达外源基因中的应用。
...【技术特征摘要】
1.rh1基因作为植物遗传转化色素报告基因的用途；所述的rh1基因的核苷酸序列为seq id no.2所示。
2.一种含有色素报告基因表达盒的植物遗传转化载体，其特征在于，所述的色素报告基因是rh1基因；所述的rh1基因的核苷酸序列为seq idno.2所示。
3.一种可视化植物多基因编辑载体，包括sgrna表达盒和cas9表达盒，所述的sgrna表达盒为2个或2个以上且sgrna表达盒串联在一起；每个sgrna表达盒的组成元件包括紫花苜蓿内源u6启动子、靶向植物基因的靶标序列sgrna和终止子；所述靶向植物基因的靶标序列sgrna的数量为2个或2个以上且采用trna将每个靶标序列sgrna串联在一起；其特征在于，所述植物多基因编辑载体中插入色素报告基因表达盒。
4.根据权利要求3所述的可视化植物多基因编辑载体，其特征在于，在所述植物多基因编辑载体的pmei酶切位点处插入色素报告基因表达盒。
5.根据权利要求4所述的可视化植物多基因编辑载体，其特征在于，所述的色素报告基因表达盒包括：启动子，色素报告基因和终止子，其中，所述的色素报告基因是rh1基因或ruby基因；其中，所述的rh1基因的核苷酸序列为seq id no.2所示；所述的ruby基因的核苷酸序列为seq id no.4所示；所述的启动子是cmylcv启动子，所述的cmylcv启动子的核苷酸序列为seq id no.1所示；所述的终止子是athspt终止子，所述的athspt终...
【专利技术属性】
技术研发人员：牛丽芳，夏秀芝，李世豪，程潘旭，林浩，王召明，苑峰，刘亚玲，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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