【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，具体为用于hsd3b1基因型检测的免提取qpcr检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
1、hsd3b1基因编码3β-羟化类固醇脱氢酶1(3βhsd1)，该酶催化性腺外前体转化为双氢睾酮（dht）；hsd3b1（1245a>c）突变导致编码氨基酸由天冬氨酸转变为苏氨酸，使3βhsd1酶降解减少，从而导致从性腺外（如肾上腺）雄激素前体合成dht增加。最终促进crpc的发生发展，以及adt治疗的反应和结果，很多疾病的治疗、转归与遗传有关，不同群体和个体对疾病的易感性、对药物的反应性有差异，其遗传学基础是人类基因组dna序列的变异性，其中最常见的突变为snp，通过对hsd3b1（a1245c）位点基因型的检测，可筛选出adt治疗效果好的人群，并对患者疗效进行预测，从而实现前列腺癌的个体化治疗指导。
2、针对基因型位点常用的检测方法有pcr产物直接测序法、arms-qpcr法等，dna直接测序操作繁琐费时且敏感度低，而arms-qpcr法灵敏度高、操作简便等特点在多种医学检测领域得到广泛应用，目前已经在临床上应用的荧光pcr检测试剂和方法多达上百种，常规通过荧光pcr检测核酸的方法一般是在核酸纯化基础上，进一步将核酸模板加入反应体系中进行pcr检测，一般核酸提纯过程需要经过裂解、纯化、洗涤和收集等步骤，样本的处理往往耗时数十分钟，由于繁多的操作步骤，在大样本处理过程中，样本之间的相互污染也不可避免。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提
2、为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：用于hsd3b1基因型检测的免提取qpcr检测试剂盒及其检测方法，包括pcr水、野生型引物探针、突变型引物探针、2xqpcr mix和阳性质控品，所述2xqpcr mix包括pcrbuffer、dntps、mgcl2、高效抗逆dna聚合酶，所述野生型引物探针包括hsd3b1（a1245c）位点引物探针、seq id no.1、seq idno.2、seq id no.4，所述突变型引物探针包括hsd3b1（a1245c）位点引物探针。
3、优选的，所述2xqpcr mix中pcrbuffer、dntps、mgcl2、高效抗逆dna聚合酶的含量依次为2.5μl、2μl、3μl、1μl，并用水补至12.5μl，所述dntps包括浓度为10mmol/l的each，所述mgcl2的浓度为25mm。
4、优选的，所述野生型引物探针中seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4的含量依次为0.2-0.8μl、0.2-0.8μl、0.2-0.4μl，浓度均为10μmol/l，所述hsd3b1（a1245c）位点引物探针包括seq id no.1、seq id no.3、seq id no.4，含量依次为0.2-0.8μl、0.2-0.8μl、0.2-0.4μl，浓度均为10μmol/l。
5、一种检测人hsd3b1（a1245c）位点变异的引物，所述hsd3b1（a1245c）位点检测的共用正向引物序列为seq id no.1，反向野生型引物序列为seq id no.2，反向突变型特异性引物序列为seq id no.3。
6、一种检测人hsd3b1（a1245c）位点变异的探针，所述hsd3b1（a1245c）位点检测的探针序列为seq id no.4。
7、用于hsd3b1基因型检测的免提取qpcr检测方法，包括以下步骤：使用人血清或血浆样本，不经核酸抽提过程，直接加入反应体系作为pcr模板加入到荧光pcr检测反应体系中进行检测。
8、优选的，所述核酸抽提过程是指qpcr检测反应体系之外，对样本进行核酸提取纯化的过程，所述将样本的处理过程与qpcr检测反应整合于同一反应体系中，所述作为qpcr的扩增模板的样本包括人血清或血浆样本。
9、优选的，具体包括以下步骤：
10、s1、将血清、血浆样本或阳性质控品各2µl分别加入野生型和突变型pcr反应管中；
11、s2、向野生型pcr反应管中加入pcr水、2xqpcr mix、野生型引物探针，向突变型pcr反应管中加入pcr水、2xqpcr mix、突变型引物探针，总体系25μl；
12、s3、盖好管盖，进行荧光pcr检测。
13、优选的，所述s2中pcr水、2xqpcr mix的添加量为8μl、12.5μl，所述野生型引物探针的添加量为2.5μl，所述突变型引物探针的添加量为2.5μl，所述s3中荧光pcr检测的扩增反应条件为：95-97℃预变性5min，95-97℃变性5s，57-62℃退火20-30s，40个循环。
14、用于hsd3b1基因型检测的免提取qpcr检测试剂盒的判定方法，包括有效性判定与结果判读，所述有效性判定为样本检测野生型pcr反应管与突变型pcr反应管ct值为undet或40，该检测失败，未加入样本，重新检测，所述结果判读为突变型与野生型δct(2，+∞)，此样品为野生纯和型aa，突变型与野生型δct[-2，2]，此样品为杂和型ac，突变型与野生型δct(-∞，-2)，此样品为突变纯和型cc。
15、本专利技术提供了用于hsd3b1基因型检测的免提取qpcr检测试剂盒及其检测方法。具备以下有益效果：
16、1、本专利技术通过突变特异性引物和探针可检测到500copies/ml浓度的hsd3b1基因（1245c）位点基因型片段，其敏感性高，检测过程为人血清样本免提取进行荧光pcr检测，减少实验步骤，并大大降低了污染的可能性，且操作简单快速，从标本送检到得出结果可在1个小时以内完成，从而解决了常规通过荧光pcr检测核酸的方法，由于繁多的操作步骤，在大样本处理过程中，样本之间相互污染的问题。
17、2、本专利技术的试剂盒能快速、准确、高敏感度的检测人hsd3b1基因（1245c）位点基因型，尤其无需进行dna提取，直接用样本进行检测。
18、3、本专利技术将人血清或血浆直接作为模板，加入优化的pcr反应体系中进行检测，过程一步完成，无需开盖，既能减少实验操作步骤，节省时间，同时还避免了开盖操作可能带来的样本污染。
19、4、本专利技术的引物探针针对hsd3b1基因（1245c）位点基因型区域序列设计，分别在突变特异性下游引物的3’端引入一个或者多个碱基的突变使其特异性扩增突变型等位基因，在突变位点之外数碱基设计突变非特异性下游引物，用以同时扩增野生型和突变型等位基因，对hsd3b1基因（124本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于HSD3B1基因型检测的免提取qPCR检测试剂盒，包括PCR水、野生型引物探针、突变型引物探针、2XqPCR Mix和阳性质控品，其特征在于：所述2XqPCR Mix包括PCRbuffer、dNTPs、MgCl2、高效抗逆DNA聚合酶，所述野生型引物探针包括HSD3B1（A1245C）位点引物探针、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4，所述突变型引物探针包括HSD3B1（A1245C）位点引物探针。
2.根据权利要求1所述的用于HSD3B1基因型检测的免提取qPCR检测试剂盒，其特征在于：所述2XqPCR Mix中PCRbuffer、dNTPs、MgCl2、高效抗逆DNA聚合酶的含量依次为2.5μL、2μL、3μL、1μL，并用水补至12.5μL，所述dNTPs包括浓度为10mmol/L的each，所述MgCl2的浓度为25mM。
3.根据权利要求1所述的用于HSD3B1基因型检测的免提取qPCR检测试剂盒，其特征在于：所述野生型引物探针中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4的含量
4.一种检测人HSD3B1（A1245C）位点变异的引物，其特征在于，所述HSD3B1（A1245C）位点检测的共用正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向野生型引物序列为SEQ ID NO.2，反向突变型特异性引物序列为SEQ ID NO.3。
5.一种检测人HSD3B1（A1245C）位点变异的探针，其特征在于，所述HSD3B1（A1245C）位点检测的探针序列为SEQ ID NO.4。
6.用于HSD3B1基因型检测的免提取qPCR检测方法，其特征在于：用于权利要求1-3任一项所述的用于HSD3B1基因型检测的免提取qPCR检测试剂盒，包括以下步骤：使用人血清或血浆样本，不经核酸抽提过程，直接加入反应体系作为PCR模板加入到荧光PCR检测反应体系中进行检测。
7.根据权利要求6所述的用于HSD3B1基因型检测的免提取qPCR检测方法，其特征在于：所述核酸抽提过程是指qPCR检测反应体系之外，对样本进行核酸提取纯化的过程，所述将样本的处理过程与qPCR检测反应整合于同一反应体系中，所述作为qPCR的扩增模板的样本包括人血清或血浆样本。
8.根据权利要求6所述的用于HSD3B1基因型检测的免提取qPCR检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的用于HSD3B1基因型检测的免提取qPCR检测方法，其特征在于：所述S2中PCR水、2XqPCR Mix的添加量为8μL、12.5μL，所述野生型引物探针的添加量为2.5μL，所述突变型引物探针的添加量为2.5μL，所述S3中荧光PCR检测的扩增反应条件为：95-97℃预变性5min，95-97℃变性5s，57-62℃退火20-30s，40个循环。
10.用于HSD3B1基因型检测的免提取qPCR检测试剂盒的判定方法，其特征在于：应用于权利要求6所述的用于HSD3B1基因型检测的免提取qPCR检测方法，包括有效性判定与结果判读，所述有效性判定为样本检测野生型PCR反应管与突变型PCR反应管Ct值为Undet或40，该检测失败，未加入样本，重新检测，所述结果判读为突变型与野生型ΔCt(2，+∞)，此样品为野生纯和型AA，突变型与野生型ΔCt[-2，2]，此样品为杂和型AC，突变型与野生型ΔCt(-∞，-2)，此样品为突变纯和型CC。
...【技术特征摘要】
1.用于hsd3b1基因型检测的免提取qpcr检测试剂盒，包括pcr水、野生型引物探针、突变型引物探针、2xqpcr mix和阳性质控品，其特征在于：所述2xqpcr mix包括pcrbuffer、dntps、mgcl2、高效抗逆dna聚合酶，所述野生型引物探针包括hsd3b1（a1245c）位点引物探针、seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4，所述突变型引物探针包括hsd3b1（a1245c）位点引物探针。
2.根据权利要求1所述的用于hsd3b1基因型检测的免提取qpcr检测试剂盒，其特征在于：所述2xqpcr mix中pcrbuffer、dntps、mgcl2、高效抗逆dna聚合酶的含量依次为2.5μl、2μl、3μl、1μl，并用水补至12.5μl，所述dntps包括浓度为10mmol/l的each，所述mgcl2的浓度为25mm。
3.根据权利要求1所述的用于hsd3b1基因型检测的免提取qpcr检测试剂盒，其特征在于：所述野生型引物探针中seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4的含量依次为0.2-0.8μl、0.2-0.8μl、0.2-0.4μl，浓度均为10μmol/l，所述hsd3b1（a1245c）位点引物探针包括seqid no.1、seq id no.3、seq id no.4，含量依次为0.2-0.8μl、0.2-0.8μl、0.2-0.4μl，浓度均为10μmol/l。
4.一种检测人hsd3b1（a1245c）位点变异的引物，其特征在于，所述hsd3b1（a1245c）位点检测的共用正向引物序列为seq id no.1，反向野生型引物序列为seq id no.2，反向突变型特异性引物序列为seq id no.3。
5.一种检测人hsd3b1（a1245c）位点变异的探针，其特征在于，所述hsd3...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋曈，郭兴中，那溶，徐丹枫，黄答，施若凡，
申请(专利权)人：上海翊辉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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